阿托伐他汀对对比剂肾病大鼠肾脏细胞凋亡及FAS/FASL表达的影响

柳青　戴春

[摘要] 目的 研究阿托伐他汀对对比剂肾病大鼠肾脏细胞凋亡及FAS/FASL表达的影响。 方法 清洁级雄性SD大鼠32只随机分为A（正常组）、B（实验对照组）、C（造模组）、D（他汀组）4组，每组8只。他汀组于造模前3 d至造模后3 d给予阿托伐他汀30 mg/（kg·d）灌胃，其余组给予等体积的生理盐水灌胃。建立对比剂肾病大鼠模型，其中C、D组注射吲哚美辛、N—硝基—L—精氨酸甲酯、泛影葡胺，B组以生理盐水代替泛影葡胺，A组只注射等体积的生理盐水。采集各组大鼠造模前、造模后48 h的血液，用全自动生化分析仪检测血肌酐（SCr）值；造模72 h后处死大鼠摘取右肾，采用原位末端标记法（TUNEL）检测肾脏细胞凋亡情况；免疫组化法检测肾脏FAS、FASL表达变化。 结果 ①C组造模前血SCr较造模后升高>25%（P < 0.05），且造模后C组血SCr较A、B、D各组有所升高（P < 0.05）；②C组较A、B组肾脏凋亡细胞数明显增多，FAS和FASL的表达亦显著增强（P < 0.05），D组较C组凋亡细胞数减少，FAS和FASL的表达减弱（P < 0.05）。 结论 阿托伐他汀可能通过减弱凋亡相关蛋白FAS和FASL的表达而抑制肾脏细胞凋亡，从而发挥其预防保护作用。

[关键词] 阿托伐他汀；对比剂肾病；细胞凋亡；大鼠；FAS/FASL

[中图分类号] R692.9[文献标识码] A[文章编号] 1673—9701（2012）24—0020—03

The effects of atorvastatin on apoptosis and the expression of FAS and FASL in the kidney of contrast—induced nephropathy in rats

LIU Qing DAI Chun

Department of Nephrology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221000，China

[Abstract] Objective To investigate the effects of atorvastatin on apoptosis and the expression of FAS and FASL in the kidney of contrast—induced nephropathy in rats. Methods Thirty—two clean male SD rats with mean of weight （200±10） g were randomly divided into four groups，8 rats in each group. There were A group（normal group），B group （experimental control group），C group （contrast—induced nephropathy group），D group （atorvastatin intervention group）. In D group， atorvastatin was gavaged from 3 before days modeling to 3 days after it， and the remaining group was given an equal volume of saline. Establish the rat model of the contrast—induced nephropathy. Indomethacin，N—nitro—L—arginine methyl ester and diatrizoate were all injected in C and D groups，when the group B with aline instead of diatrizoate， group A only injected with saline. Then collected the blood before modeling and 48h after modeling. Serum creatinine （SCr） were detected by automatic biochemistry analyzer. After modeling 72 h， rats were killed to get the right kidney. Apoptosis was evaluated by means of terminal—deoxynucleotidyl transferase mediated d—UTP nick end labeling（TUNEL）. And，immunohistochemistry were used to detect the expression of FAS and FASL. Results ①After modeling，the levels of SCr increased significantly in C group （P < 0.05），as well as compared with the other three groups （P < 0.05）. ②Compared with those of the kidneys in the group A and group B， apoptotic cells were more in number and the expression of FAS and FASL was higher in the modeling group （P < 0.05）. The number of apoptotic cells and the level of expression of FAS and FASL were reduced by atorvastatin treatment （P < 0.05）. Conclusion Atorvastatin has some renal protective effect on contrast—induced nephropathy，partly through inhibiting apoptosis by down—regulating FAS and FASL expression.

[Key words] Atorvastatin； Contrast—induced nephropathy； Apoptosis； Rat； FAS/FASL

近年来他汀类药物对对比剂肾病（contrast—induced nep—hropathy，CIN）的预防作用受到极大关注。国内外许多研究表明，阿托伐他汀术前给药可以减少术后CIN的发生，并存在剂量依赖性效应[1]。但他汀类药物预防CIN的机制未完全阐明。

细胞凋亡参与多种肾脏疾病的发生、发展及修复过程[2]。对比剂在肾小管和集合管高度浓缩，可直接损伤上皮细胞，诱导其凋亡。细胞凋亡受多种因素调控，受体介导的凋亡途径中，FAS/FASL系统最具代表性。他汀类药物是否通过影响肾脏的细胞凋亡及凋亡相关蛋白FAS、FASL来预防CIN的呢？本研究通过建立对比剂肾病大鼠模型，观察不同干预组肾脏细胞凋亡的情况及FAS、FASL表达的情况，以进一步探讨他汀类药物对CIN的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象

健康雄性SD大鼠（徐州医学院动物中心提供）32只，清洁级，体重（200±10） g。

1.2 主要试剂及器材

阿托伐他汀（立普妥，辉瑞制药有限公司）；吲哚美辛（美国Sigma公司）；N—硝基—L—精氨酸甲酯（美国Sigma公司）；泛影葡胺（上海旭东海普药业有限公司）；TUNEL试剂盒（罗氏公司）；一抗为兔抗FAS/FASL抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；二抗为生物素化羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；全自动生化分析仪（Olympus AU 2700型）；台式高速离心机（LDZ5—2型）；电热恒温培养箱（HG303—3型）；Olympus显微摄像系统（日本Olympus公司）。

1.3方法

1.3.1 分组方法实验随机分为4组，每组8只：正常组（生理盐水灌胃、股静脉注射生理盐水）；实验对照组（生理盐水灌胃，股静脉分别注射吲哚美辛、N—硝基—L—精氨酸甲酯和生理盐水）；造模组（生理盐水灌胃，股静脉分别注射吲哚美辛、N—硝基—L—精氨酸甲酯和泛影葡胺）；他汀组（阿托伐他汀灌胃，股静脉注射同造模组）。

1.3.2 建立对比剂肾病大鼠模型[3]造模前大鼠禁水12 h，自由进食。称重后按10%水合氯醛 0.32 mL/100 g 腹腔注射麻醉，平卧位备皮、酒精消毒后分离左股静脉，插入留置针并固定，每隔15分钟分别注射吲哚美辛（1 mg/100 g）、N—硝基—L—精氨酸甲酯（1 mg/100 g）和泛影葡胺（10 mL/kg）。

1.3.3 药物干预他汀组于造模前3天、造模当天及造模后3 d连续应用30 mg/（kg·d）[4]阿托伐他汀灌胃；其余3组均使用等量生理盐水灌胃。

1.3.4 标本留取造模前及造模后48 h经大鼠眼底静脉丛采血1 mL，离心取上清液。造模后72 h杀鼠取右肾，10%中性甲醛固定、石蜡包埋、切片。

1.3.5 指标检测①全自动生化分析仪检测造模前后各组大鼠SCr。②原位检测细胞凋亡：采用罗氏分装TUNEL试剂盒，根据说明书略做改良。切片厚约4 μm，常规脱蜡至水，经3%H2O2处理、蛋白酶K消化后，加入TUNEL反应液和转化剂—POD，4℃过夜，DAB显色，光镜观察凋亡信号，切片随机选取5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分率，胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞。③免疫组化检测FAS、FASL：一抗为兔抗FAS/FASL抗体；二抗为生物素化羊抗兔IgG。采用SABC免疫组化检测，经DAB显色后，光镜下观察结果，每例分别随机选取5个高倍视野，计算每个视野内染色区域的光密度值。

1.4 统计学处理

实验数据采用SPSS 16.0统计学软件进行处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用方差分析（ANOVA）。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1造模前后各组大鼠血肌酐值

造模组血SCr造模前较造模后升高> 25%，且造模后C组血SCr较各组有所升高（P < 0.05）。

2.2 TUNEL结果

光镜下，造模组较A、B两组肾脏凋亡细胞数明显增多，阳性细胞百分率增高（P < 0.05），D组（他汀组）较C组（造模组）凋亡细胞数减少，阳性细胞百分率减少（P < 0.05）。

2.3 免疫组化结果

C组（造模组）较A、B两组肾脏FAS及FASL的表达显著增强（P < 0.05），D组（他汀组）较C组（造模组）肾脏FAS和FASL的表达减弱（P < 0.05）。

3 讨论

CIN指使用对比剂48 h内发生的无其他原因可解释的急性肾功能损害性疾病，通常以血清肌酐上升超过44.2 μmol/L（即0.5 mg/dL）或较造影前的基础水平升高超过25%为诊断标准[5，6]。本研究中，大鼠血液采集的时间点为造模后48 h，结果示造模组血SCr较造模前水平升高（P < 0.05），且上升幅度均大于造模前25%，符合上述诊断标准。

对比剂肾病的发病机制尚未明确，高浓缩的对比剂不仅能直接损伤肾小管（对比剂使肾小管上皮细胞Ca2+内流增加，胞浆内Ca2+浓度增高，细胞骨架破坏），诱导细胞凋亡，而且CIN发病过程中产生的氧自由基、炎症因子等也参与了细胞凋亡[8]。尤其是肾脏缺血、缺氧时，凋亡更易发生。Yano等[9]研究发现，对比剂可导致促凋亡基因Bax mRNA表达升高，抑凋亡基因bcl2 mRNA表达下降而促进细胞凋亡。本实验中C组（造模组）肾脏凋亡细胞数明显比其他三组增多（P < 0.05），也证明了凋亡确实存在于CIN中。

细胞凋亡受多种因素调控，受体介导凋亡途径中，FAS/FASL系统最具代表性。FAS及 FASL是诱发肾脏多种细胞发生凋亡的蛋白。FASL属于TNF（肿瘤坏死因子）细胞因子超家族，FAS属于细胞膜受体中的一员，FAS和FASL结合，在细胞毒性T细胞（CTL）介导的细胞毒作用和细胞凋亡中起重要作用，CTL激活后诱导自身表达FASL，并与靶细胞表面FAS结合，触发靶细胞的死亡信号，引发DNA断裂，发生凋亡。以往认为，FASL只存在于免疫系统淋巴细胞表面，但在肾组织也存在CTL表面的FASL与靶细胞的FAS结合，对小球小管和间质细胞产生细胞毒作用。本研究中，C组（造模组）肾脏FAS、FASL的表达明显比其他三组增强（P < 0.05），说明FAS/FASL系统在CIN中的表达被广泛激活。

他汀类药物目前预防CIN的机制尚未明确，但他汀类药物调节细胞增殖/凋亡平衡的作用得到肯定，特别对于高血压肾病、糖尿病肾病等系膜增殖性肾病，长期应用他汀类药物可以抑制系膜细胞的增殖、促进凋亡[14]。但这种作用与他汀类药物的作用时间、剂量、药物种类、不同病理损伤有关。他汀类药物在慢性肾脏病上表现的是促进凋亡，但在CIN这种急性肾损伤中，短期大量用药是否对肾脏细胞起抗凋亡作用是本实验要研究的。本研究中，D组（他汀组）肾脏细胞凋亡数较造模组有所下降（P < 0.05），血SCr的含量及FAS/FASL的表达也明显减弱（P < 0.05），说明阿托伐他汀对肾脏起保护作用，减少了CIN的发生，并且这种保护作用和细胞凋亡的减少有关。

虽然本研究存在一定的局限性，如样本数量较少、不能排除其他混杂因素的影响等，但本实验仍能表明，阿托伐他汀可以预防CIN的发生，并且减少细胞凋亡，其具体的机制需要用更多的样本和其他技术去继续探讨。

[参考文献]

[1]Giuseppe P，Annunziata N，Massimo C，et al. Usefulness of statin pretreatment to prevent contrast—induced nephropathy and to improve long—term outcome in patients undergoing percutaneous coronary intervention[J].Am J Cardiol，2008，101：279—285.

[2]Zhang W，Khanna P，Chan LL，et al. Diabetes—induced apoptosis in rat kidney[J]. Biochem Mol Med，1997，61：58—62.

[3]Goodman AI. Heme oxygenase—1 protects against radio contrast—induced acute kidney injury by regulating anti—apoptotic proteins[J]. Kidney Int，2007，72（8）：945—953.

[4]张炜，顾民. 阿托伐他汀对大鼠移植肾骨桥蛋白表达的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2007，11（4）：605—609.

[5]Liistro F，Falsini G，Bolognese L. The clinical burden of contrast media—induced nephropathy[J]. Ital Heart J，2003，4（10）：668.

[6]Peter A. Nephrotoxicity and the role of contrast media[J]. Radial Med，2004，22（6）：377.

[7]杜敏，马淑梅. 造影剂肾病[J]. 实用药物与临床，2009，12（1）：55—58.

[8]Hizch I，Streater J，Schick CS，et al. Radiocontrast—induced DNA fragmentation of renal tubular cells in vrtio：role of hypertonicity[J]. Nephrol Dial—Transplant，1998，13（4）：911—918.

[9]Yano T，Itoh Y，Sendo T，et al. Cyclic AMP reverses radio contrast media—induced apoptosis in LLC—PK1 cells by activating A kinase/PI3 kinase[J]. Kidney Int，2003，64（6）：2052—2063.

[10]Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide[J]. Science，1995， 267：1445—1449.

[11]Suda T，Takahashi，Golstein G，et al. Molecular cloning and expression of the Fas ligand，a novel member of the tumor necrosis factor family[J].Cell，1993，75：1169—1178.

[12]Smith C，Farrah T，Goodwin G，et al. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins： activation，constimulation，and cell death[J]. Cell，1994，76：959—962.

[13]张新爽，刘亚玲，张艳玲. 苯那普利对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及Fas和FasL表达的影响[J]. 河北医药，2003，25（4）：243—245.

[14]洪富源，黄一新. 他汀类药物非降脂作用对肾保护研究新进展[J]. 国外医学：泌尿系统分册，2003，23（3）：325—328.

（收稿日期：2012—06—19）