高效液相色谱-荧光检测畜禽粪污中四种氟喹诺酮类抗生素残留

张敏 刘庆玉 敖永华

摘要：为了建立高效液相色谱－荧光测定畜禽粪污中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留的分析方法，将畜禽粪便样品经乙腈超声提取，再经正己烷液－液萃取，并经氮吹浓缩，乙腈与水混合溶解残渣，过微孔滤膜，采用高效液相色谱－荧光检测，以０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四丁基溴化胺（ｐＨ ３．０）／乙腈（９４／６，Ｖ／Ｖ）为流动相，于激发波长２８０ ｎｍ、发射波长４８０ ｎｍ处进行检测。结果表明，畜禽粪污样品中４种喹诺酮类抗生素的平均回收率为７７．８％～９８．２％，相对标准偏差为３．５％～７．２％，检测限为０．００５～０．０１0 μｇ／ｋｇ。该方法简便、快速，可满足畜禽粪污中4种喹诺酮类兽药残留量的同时检测。

关键词：畜禽粪污；喹诺酮类抗生素；高效液相色谱法；荧光检测

中图分类号：Ｏ６５７．７＋２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）03－0602-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒ Kinds of Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｓｏｔｃｋ Ｆｅｃｅｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ＺＨＡＮＧ Ｍｉｎ，ＬＩＵ Ｑｉｎｇ－ｙｕ，ＡＯ Ｙｏｎｇ－ｈｕａ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｌｉｖｅｓｏｔｃｋ ｆｅｃｅｓ． Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｌｌｙ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａ ｄｏｕｂｌｅ ｌｉｑｕｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎ－ｈｅｘａｎｅ． Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ｗａｓ ｖａｐｏｒｉｚｅｄ ｂｙ nitrogen stream， ｆｏｕｒ ａｎａｌｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ high performance liquid chromatography-ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ２８０ ｎｍ ａｎｄ ４８０ ｎｍ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｕｓｉｎｇ ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ｐＨ ３．０）／ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ （９４／６，Ｖ／Ｖ） ａｓ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ｉｎ ｌｉｖｅｓｏｔｃｋ ｆｅｃｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ７７．８％ ｔｏ ９８．２％， and ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ were ３．５％～７．２％． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ ｆｏｕｒ ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｆｒｏｍ ０．００５ ｔｏ ０．０１0 μｇ／ｋｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｕｌｔｉｒｅｓｉｄｕｅｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｅａｓｙ ａｎｄ ｆａｓｔ． Ｉｔ ｈａｓ ａｌｓｏ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ four kinds of ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｆｅｃｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｆｅｃｅｓ； ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ； ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔ

近年来，随着集约化畜牧业以及配合饲料工业的发展，抗生素作为饲料添加剂等越来越被广泛地应用于畜禽养殖业中。兽用药物在保障动物健康、提高畜禽生产力和改善人民生活水平等方面都起着重要的作用，兽用药物的种类及用量与日俱增，尽管抗生素作为兽药和饲料添加剂在畜禽疾病防治和生长促进方面发挥了较大的作用，然而，抗生素通过口服或肌肉注射进入动物体内后，仅少量被内脏器官吸收利用，约３０％～９０％以原药和代谢产物的形式经动物的粪便和尿液进入生态环境中，给环境土壤、表层水体等生态环境带来不良影响［１］。目前，畜禽养殖粪便及其施肥土壤中的兽用抗生素污染已经达到较为严重的程度，畜禽粪便中抗生素带来的环境污染问题引起了各方面的关注和重视［２］。

喹诺酮类药物是最近２０年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素，是继磺胺类药物之后人类在合成抗生素方面最重要的突破，其抗菌作用是磺胺类药物的近千倍。氟喹诺酮（Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ，ＦＱｓ）类药物是第三代喹诺酮类药物，广泛地用于畜禽的细菌、霉形体病防治，已投入使用或即将进人兽医领域的药物有１０多种，目前国内外已批准用于动物的ＦＱｓ包括恩诺沙星（Ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＥＮＲ）、诺氟沙星（Ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ，ＮＯＲ）、环丙沙星（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＣＩＰ）、氧氟沙星（Ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＯＦＬ）等［３］。

近年来，氟喹诺酮类抗生素已在水环境、土壤环境和畜禽废物中有不同程度的检出［４－８］。对水环境、土壤、肉、奶、蛋等中氟喹诺酮类抗生素残留检测技术的研究较多，主要是采用液相色谱－质谱联用方法，但利用高效液相色谱仪分析畜禽粪便中氟喹诺酮类抗生素的报道很少。为此，本研究建立了高效液相色谱－荧光检测同时测定土壤中４种氟喹诺酮类抗生素的分析方法，旨为畜禽粪便中抗生素兽药残留提供技术支持。

１材料与方法

１．１仪器与试剂

Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪（配荧光检测器），Ｍｉｌｌｉｏｎ－Ｑ超纯水制备系统，超声波清洗器，旋涡混合器，离心机，精密ｐＨ计，氮吹仪等。

４种氟喹诺酮类抗生素标准品：氧氟沙星（ＯＦＬ）、诺氟沙星（ＮＯＲ）、环丙沙星（ＣＩＰ）和恩诺沙星（ＥＮＲ），纯度＞９９．０％，Ｓｉｇｍａ公司。甲醇和乙腈，色谱纯，Ｆｉｓｈｅｒ公司；其余试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。

１．２试验方法

１．２．１粪尿样品的前处理

1）畜禽粪便：准确称取待测鸡或猪粪便１０.00 ｇ，置于５０ ｍＬ离心管中，加２０ ｍＬ乙腈和２ ｇ无水硫酸钠浸泡提取，在漩涡混匀器上以２ ５００ ｒ／ｍｉｎ混匀１ ｍｉｎ，４５ ℃超声２５ ｍｉｎ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，将上清液转入浓缩瓶中，再重复提取两次，合并上清液，样品上层清液用４０ ｍＬ正己烷萃取两次，氮气吹至近干，用２ ｍＬ乙腈饱和的正己烷溶解残余物，转入１０ ｍＬ离心管中，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃去正己烷层，下层清液用尼龙微孔滤膜过滤，供高效液相色谱仪测定。

2）畜禽尿液及养殖废水：取畜禽尿液及养殖废水３０ ｍＬ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，将上层清液用４０ ｍＬ正己烷萃取两次，氮气吹至近干，用２ ｍＬ乙腈饱和的正己烷溶解残余物，转入１０ ｍＬ离心管中，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃去正己烷层，下层清液用尼龙微孔滤膜过滤，供高效液相色谱仪测定。

１．２．２色谱条件Ｗａｔｅｒｓ色谱柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）；激发波长为２８０ ｎｍ，发射波长为４８０ ｎｍ；柱温为４０ ℃；进样量为１０ μＬ；流动相为０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四丁基溴化胺（ｐＨ３．０）／乙腈（９４／６，Ｖ／Ｖ）；流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。

１．２．３标准曲线分别精确称取０．０１０ ０ ｇ氟喹诺酮类抗生素于１００ ｍＬ容量瓶中，再加入１０ ｍＬ ０．０３ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠进行溶解，用乙腈定容至刻度，摇匀，得１００ μｇ／ｍＬ的标准储备液。将标准储备液逐级稀释，依次得０．０１、０．０２、０．０５、０．１０、０．２０、０．５０、１．００ μｇ／ｍＬ的标准品工作液，以色谱峰面积对质量浓度作图，得出氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星四种氟喹诺酮类抗生素兽药的标准曲线。

２结果与分析

２．１色谱条件的选择

２．１．１流动相的选择氟喹诺酮类药物属两性化合物，具有两性官能基团，在水溶液中均以离子形式存在，在流动相中加入离子对试剂可以降低其极性以改善峰形和提高分离度。研究过程中分别以不同离子对试剂为流动相考察对氟喹诺酮分离的影响。试验确定了０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四丁基溴化胺与乙腈（９４／６， Ｖ／Ｖ）溶液为流动相，可获得４种喹诺酮类抗生素标准溶液的色谱分离图（图１），２5 ｍｉｎ内均能达到基线分离。

２．１．２检测波长的确定氟喹诺酮类药物含苯环结构和共轭大π键，因此有较高的荧光效率，可采用荧光检测器进行定量分析。采用荧光检测比紫外检测高１～２个数量级。对４种氟喹诺酮类药物分别进行激发－发射波长扫描，结合其最大吸收波长，实验确定了激发波长为２８０ ｎｍ和发射波长为４８０ ｎｍ为荧光检测条件。

２．２线性关系和检出限

在选定的色谱条件下，取不同浓度的４种氟喹诺酮标准混合溶液分别进样，以峰面积对进样量进行线性回归，４种氟喹诺酮类药物在０．０1～１．００ μｇ／ｍＬ范围内，浓度和峰面积呈现良好的线性关系，可以满足定量分析的需要，其线性范围见表１。以信噪比（Ｓ／Ｎ）为３计算方法的检出限（ＬＯＤ），对氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检测限分别为：０．０１0、０．００５、０．０１0和０．０１0 μｇ／kg。

２．３回收率和精密度

配制不同浓度的混合标样，分别对畜禽粪污样品和空白样品进行添加回收实验。４种氟喹诺酮类药物的添加回收率均在７７．８％～９８．２％之间，其多次测定的相对标准偏差在３．５％～７．２％之间，该方法稳定性和重现性均较好，能满足畜禽粪便中氟喹诺酮类药物残留检测。回收率和方法的相对标准偏差见表２，空白谱图和添加浓度０．０1 ｍｇ／ｋｇ的色谱图见图２和图３。

３结论

运用所建立的方法对４种氟喹诺酮类药物在各基质中进行检测，平均回收率在７７．８％～９８．２％之间， 检测限为０．００５～０．０１0 μｇ／ｋｇ，测定的相对标准偏差在３．５％～７．２％之间，且各药物浓度和峰面积呈现良好的线性关系，表明方法的准确性、精密度和灵敏度均符合残留分析要求。所建立的方法操作简便、灵敏度高，适用于畜禽粪污中４种氟喹诺酮类药物残留的同时测定。

参考文献：

［１］ ＳＡＲＭＡＨ Ａ Ｋ， ＭＥＹＥＲ Ｍ Ｔ， ＢＯＸＡＬＬ Ａ． Ａ ｇｌｏｂａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ， ｓａｌｅｓ， ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｐａｔｈｗａｙｓ， ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｆａｔｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（ＶＡｓ） ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，２００６，６５（5）：７２５－７５９．

［２］ 王惠惠，王淑平． 畜禽排泄物中抗生素残留与控制技术研究进展［Ｊ］． 土壤通报，２０１１，４２（１）：２５０－２５６．

［３］ 王战辉，沈建忠，张素霞．喹诺酮类药物抗体制备研究进展及策略分析［Ｊ］． 中国农业科学，２００８，４１（１０）：３３１１－３３１７．

［４］ 邰义萍，莫测辉，李彦文，等． 长期施用粪肥土壤中喹诺酮类抗生素的含量与分布特征［Ｊ］．中国环境科学，２０１０，３０（６）：８１６－８２１．

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［７］ ＳＣＨＮＥＩＤＥＲ Ｍ Ｊ， ＢＢＲＡＤＥＮ Ｓ Ｅ， ＲＥＹＥＳ－ＨＥＲＲＥＲＡ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆlｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｔｅｔｒａｃｙｃ ｌｉｎｅｓ ｉｎ cｈｉｃｋｅｎ ｍｕｓｌｅ ｕｓｉｎｇ ＨＰＬＣ ｗｉｔｈ ｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００７，８４６（1-2）：８－１３．

［８］ 杨守国，李兆新，王清印，等． 高效液相色谱法检测海水养殖环境中喹诺酮类药物残留［Ｊ］，渔业科学进展，２０１０，３１（２）：９５－１０１．

（责任编辑胡西洲）

收稿日期：２０１１－０８－０１

基金项目：沈阳市科学计划项目（Ｆ１０－２３２－４－００）

作者简介：张敏（１９７８－），女，辽宁朝阳人，讲师，博士，主要从事农业污染治理和资源化利用教学和科研工作，（电话）１３６１４０２０８０６（电子信箱）

ｍｉｎｚｈａｎｇ４１２＠１６３．ｃｏｍ；通讯作者，刘庆玉，教授，博士生导师，主要从事农业生物环境与能源利用教学和科研工作，

（电子信箱）ｑｙｌｉｕ＠１２６．ｃｏｍ。