牛黄解毒片微生物限度检查方法的探讨

杜尔再 闹闹尔再

新疆巴州药品检验所，新疆 库尔勒 841000

牛黄解毒片为《中华人民共和国药典》2005年版一部品种，功能为清热解毒。临床上主要用于火热内盛，咽喉肿痛，牙齿肿痛，口舌生疮，目赤肿痛。处方中含有人工牛黄、石膏、黄芩、雄黄、大黄、桔梗、甘草、冰片等8位中药组成。而其中人工牛黄、黄芩、大黄这3味中药均具有较强的抑菌性，故必须采用适当的方法消除其抑菌性才能进行微生物限度检查。通过研究，本文对细菌计数、霉菌和酵母菌数的测定以及控制菌—大肠埃希菌、大肠菌群的检查。《中国药典》2005年版规定建立微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该制剂的细菌、霉菌和酵母菌数及控制菌的测定。本试验按照《中国药典》2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法有关规定，建立牛黄解毒片的微生物限度检查法并加以验证［1］，即采用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验确定细菌数检查法，采用白色念珠菌、黑曲霉菌试验确定霉菌和酵母菌数的检查法。按《中国药典》规定，在采用常规法、培养基稀释法等方法处理样品后，加入以上五种菌，培养后回收率达70%以上，证明该法有效消除了药品对细菌的抑制作用，可用该法进行药品微生物限度检查。本试验所用样品均由库尔勒龙之源药业有限责任公司提供，先取一个批号的样品，选用敏感菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌进行预试验，摸索出合适方法后再三个批号的样品进行平行试验。

1 仪器与材料

1.1 仪器 净化工作台型号SW－CJ－IB苏州净化设备厂;菌落计数器型号JLQ－SI江苏省无锡县电化教具厂;干燥箱 (电热鼓风)型号101－1上海实验仪器厂;高压蒸汽消毒器 (手提式)YXQ.GO1.280型上海医疗核子仪器厂;生化培养箱型号LRH－150B广州省医疗器械厂;培养箱(电热恒温)型号28YX－1银川市金属制品厂;天平 (电子)型号PL202－S/00上海梅特勒一托利多集团;生物安全柜型号BSC_1300_11_A/B3苏州市华于净化有限公司;匀浆仪 (电动)型号YJ－A浙江省台州市椒江五星机械仪器有限公司。

1.2 标准菌种

大肠埃希菌 (Escherichia coli)(CMCC(B)44102)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) (CMCC(B)26003)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) (CMCC(B)63501)、白色念珠菌 (Candida albicans) (CMCC(F)98001)、黑曲霉 (Aspergillus niger)(CMCC(F)98003)本试验所用菌种均为第三代，以上菌种均由新疆维吾尔自治区药品检验所提供。

1.3 培养基、稀释剂及试液 营养肉汤培养基 (批号:071116)、玫瑰红钠琼脂培养基 (批号:080616)、营养琼脂培养基 (批号:080708)、麦康凯琼脂培养基 (BacC)(批号:071224)、改良马丁培养基 (批号:081127)、胆盐乳糖培养基 (BL)(批号:0806042)、胆盐乳糖发酵培养基 (批号:080218)、4－甲基伞形酮葡萄糖苷酸培养基(MUG)(批号:070604)，(以上培养基生产单位为中国药品生物制品检定所，由北京牛牛基因技术有限公司提供);0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液 (批号:080925)，以上稀释剂自配;靛基质试液。

1.4 供试品 牛黄解毒片 (库尔勒龙之源药业有限责任公司)。

2 方法与结果

2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数的验证［1］

2.1.1 菌液制备 ①取经37℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释为50～100cfu/mL菌悬液，备用。②取经25℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释为50～100cfu/mL菌悬液，备用。③取经25℃培养1周的黑曲霉的斜面培养物，加5mL 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释为50～100cfu/mL菌悬液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液100mL制备成1:10供试液。

2.1.3 方法验证预试验 选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌三种敏感菌株进行预试验，摸索出合适方法。

常规法 取1∶10供试液1mL，分别加入敏感菌株金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌各50～100cfu，立即注入相应培养基15～20 mL，待培养基凝固后，置规定的温度下倒置培养。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌培养24h，白色念珠菌培养48h。培养基稀释法 取1∶10供试液0.5，0.2mL，分别注入平皿，加入敏感菌株金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌50～100cfu，注入营养琼脂培养基15～20 mL，待培养基凝固后，置规定的温度下倒置培养24h。

2.1.4 方法验证预试验结果 以上预试验的回收率结果见表1。

表1 敏感菌株对几种预试验方法的回收率结果比较

根据上述预试验结果，采用常规法及培养基稀释法(供试液:0.5mL/皿)试验时，枯草芽孢杆菌回收率均小于70%，表明牛黄解毒片对细菌抑制作用明显;采用培养基稀释法 (供试液:0.2mL/皿)试验时，枯草芽孢杆菌回收率均大于70%，表明该法有效消除了牛黄解毒片对细菌抑制作用;采用常规法试验时，白色念珠菌回收率为100%，说明牛黄解毒片对霉菌和酵母菌没有抑制作用。初步确定牛黄解毒片细菌计数方法为培养基稀释法 (供试液:0.2mL/皿)，霉菌和酵母菌计数方法为常规法。

2.1.5 细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的验证［1］取3个批号的牛黄解毒片样品，细菌按培养基稀释法 (供试液:0.2mL/皿)进行细菌回收率试验，霉菌和酵母菌按常规法进行加菌回收率试验，结果见表2。

表2 培养基稀释法 (0.2mL/皿)5种阳性菌回收率试验结果

上述试验说明，采用培养基稀释法 (供试液:0.2mL/皿)试验时，三个批号的药品中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率均大于70%，该法可用于药品细菌数检查;采用常规法试验时，三个批号的药品中白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均大于70%，该法可用于药品的霉菌和酵母菌数检查。

2.2 控制菌检查方法验证［1］

2.2.1 大肠埃希菌检查方法验证 ①试验组:取1∶10供试液10mL接种至100mL胆盐乳糖培养基 (BL)中，同时加入大肠埃希菌 10～100cfu，35℃培养 24h。取培养物0.2mL接种至5mL MUG培养基试管中，35℃培养于5，24h，在365nm紫外灯光下观察荧光，然后再进行靛基质试验。另取培养物在麦康凯琼脂培养基平板上划线，35℃培养24h，观察其菌落形态。②阴性菌对照组:取1:10供试液10mL接种至100mL胆盐乳糖培养基 (BL)中，同时加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，作为阴性菌对照试验菌，方法同试验组。结果见表3。

表3 大肠埃希菌试验结果

2.2.2 大肠菌群检查方法验证

①试验组:取1:10供试液1mL接种至10mL胆盐乳糖发酵管培养基中，同时加入大肠埃希菌10～100cfu，35℃培养18～24h。另取培养物在麦康凯琼脂培养基平板上划线，35℃培养18～24h，观察其菌落形态。②阴性菌对照组:取1:10供试液1mL接种至10mL胆盐乳糖发酵管培养基中，同时加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，作为阴性菌对照试验菌，方法同试验组。结果见表4。

3 讨论

具有抑菌性药物的微生物限度检查结果的准确性，主要取决于样品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖。检验时应排除其抑制作用，使之不干扰染菌限度检验，结果方属有效。本试验通过预试验，采用排除法确认可行的方法。3批样品的验证试验结果表明:①采用培养基稀释法对牛黄解毒片进行细菌数的测定，3种规定试验菌的回收率均大于70%，可把外界影响、制剂工艺因素(如原材料处理)和操作者的主观因素减少到最低，更客观、公正、科学，符合《中国药典》2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法的规定，方法可行。②采用常规法进行霉菌及酵母菌数的测定，两种规定试验菌的回收率均大于70%，方法可行;③采用常规法检查牛黄解毒片中的大肠埃希菌和大肠菌群，方法可行。

［1］国家药典委员会.中国药典 (一部) ［S］.北京:化学工业出版社，2005:附录70－79.