HBcAg18-27V/I变异体与严重乙型肝炎活动的关系

杨 玲，曾文铤，张 鹤，谢栩硕

(1广州医学院第一附属医院，广州510120;2南方医科大学南方医院)

人白细胞抗原(HLA)-I类限制性细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)免疫反应可能参与乙型肝炎病毒(HBV)相关的严重乙型肝炎活动(SHB)［1，2］。HLA-A2限制性特异性CTL表位HBeAg18-27能在90%的急性乙型肝炎患者体内激起强的免疫反应［3］。第27位氨基酸(core27)是该表位与HLA-A2分子结合的锚基位点，当core27位置发生改变，该表位的免疫原性发生改变［4］。HBcAg18-27V是从欧美地区的主要流行HBV基因型A、D中鉴定出来的，在我国流行的HBV基因B、C型中，HBcAg18-27主要表现为HBcAg18-27I［5］。当HBcAg18-27发生变异后，通过活化靶细胞或活化CTL而增强CTL细胞毒反应［4］。本研究观察了SHB患者HBeAg18-27的表现形式、随访后的变异情况及CTL频数变化，探讨HBeAg18-27V/I变异体与HBV相关SHB的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2008年1月～2011年6月广州医学院第一附属医院及南方医院收治的HBV感染患者，包括HBV导致SHB患者77例［男69例、女8例，年龄(35±9)岁，HBeAg阳性32例、阴性45例，血清ALT(597±607)IU/L］及慢性乙型病毒性肝炎(CHB)88例［男75例、女13例，年龄(35±9)岁，HBeAg阳性65例、阴性23例，血清ALT(139± 75)IU/L］。SHB定义为，在CHB基础上，患者血清ALT最高值≥600 U/L及总胆红素(TB)最高值≥51.3 μmol/L［6］。排除标准:①合并有甲、丙、丁型肝炎病毒及其他嗜肝病毒感染者;②肝硬化者;③严重代谢性肝病或自身免疫性肝病者;④合并人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者;⑤长期接受免疫抑制剂治疗者，包括器官移植后患者;⑥长期酗酒、戒酒未满半年者。CHB的诊断符合《病毒性肝炎防治方案》［7］中的标准:HBsAg阳性半年以上，出现轻度或中度肝炎活动，即血清ALT波动(40～80)U/L，TB≤17.1 μmol/L。从发病入院开始，每3个月对SHB患者进行随访。收集患者的血标本。

1.2 HBcAg18-27编码区扩增及测序 采用QIAGEN血清DNA抽提试剂盒提取受检者血清中的HBV DNA。用引物P1(5'-TTTT TCACCTCTGCCTAATC-3')和 P35(5'-TGATAAGATAGGGG CATTTG-3')及引物P1和HC24R(5'-CCTGAGTGCTGTATGGTGAGG-3')进行半巢式PCR扩增。扩增条件为94℃预变性1 min;接着94℃变性25 s，55℃退火25 s，72℃延伸40 s，共循环30圈;最后72℃再延伸5 min。用P1引物行PCR产物测序。

1.3 HBV基因型鉴定 采用PCR-RFLP方法。取抽提的HBV DNA，以BS1(5'-ATGAA TTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC-3')和 Pol2(5'-CGGGCAACGGGGTAAAGGTTC-3')为外引物进行第1轮PCR扩增。取第 1轮 PCR扩增产物，以 YS1(5'-GCGGGGTTTTTC TTGTTGA-3')和 YS2(5'-GGGACTCAAGATGTTG TACAG-3')为内引物再进行巢式PCR扩增。扩增条件为94℃预变性1 min;接着94℃变性20 s，55℃退火25 s，72℃延伸50 s，共循环35圈;最后72℃再延伸5 min。取第2轮PCR扩增产物，分别以内切酶BsrsⅠ和StyⅠ各37℃酶切4 h。根据图谱分型:BsrsⅠ可切的、StyⅠ不可切，为B型;BsrsⅠ不可切、StyⅠ可切，为C型。如果用上述两种内切酶仍不能确定基因型者，将PCR扩增产物进行测序，以确定其基因型。

1.4 HLA-A2鉴定及HBV特异性CTL检测 分离血标本中的单个核细胞(PBMC)并行HLA-A2染色，在其中分别加入HLA-A2-FITC 1 μL及FITC标记的IgG2b同型对照2 μL，24 h内上流式细胞仪分析 HLA-A2。分离 PBMC，行 HBcAg18-27I和HBcAg18-27V特异性五聚体(Pentamer)染色:将复苏的PBMC分别加10 μL的FITC标记的Pen18-27V或Pen18-27I，孵育洗涤细胞后，加入5 μL的APC标记的CD8，孵育洗涤后上流式细胞仪检测。检测时收集5×105个细胞，用美国BD公司的Cell Quest软件进行分析。HBV特异性的CTL细胞阳性率= (Pen18-27+CD+8细胞/CD+8细胞)×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。两组间的频数比较用Pearson chi-square检验或Fisher's Exact检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SHB、CHB患者的HBV DNA定量、HBcAg18-27表位形式及其HBV基因型 77例SHB患者的HBV DNA为(5.65±1.66)copies/mL，88例CHB患者为(7.16±1.70)copies/mL。77例SHB患者和88例 CHB患者中共有22例 (13.3%)在HBcAg18-27编码区表现为HBcAg18-27V，其中CHB患者4例(4.5%)、SHB患者18例(23.4%)，其余患者为HBcAg18-27I的形式。HBcAg18-27V流行率在SHB患者中明显高于CHB患者［23.4%(18/ 77)vs 4.5%(4/88)］，两者相比，P＜0.01。77例SHB患者中HBV基因型分别为B型50例、C型20例、D型1例，另外6例S区扩增阴性，未鉴定基因型;88例CHB患者中HBV基因型分别为B型57例、C型31例。22例HBcAg18-27V患者的HBV基因型，除1例为D型外，其余为B、C型。

2.2 随访期间SHB患者HBcAg18-27表位区变异

77例SHB患者的随访时间均超过3个月，最长达17个月。有18例在随访3个月期间死亡，分别为3例HBcAg18-27V和15例HBcAg18-27I患者。10例HBcAg18-27V或HBcAg18-27V、HBcAg18-27I混合感染患者及19例HBcAg18-27I患者在随访中获得血清标本。排除2例PCR扩增阴性的患者。9例发病时感染HBcAg18-27V病毒株或混合感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I病毒株的患者按照HLA-A2阳性或阴性分为两组:4例HLA-A2阳性的患者随访中均变异为HBcAg18-27I单一病毒株感染;而5例HLA-A2阴性的患者，随访中仍能检测到包含HBcAg18-27V的病毒株。而18例发病时感染HBcAg18-27I的患者随访后仍然为HBcAg18-27I病毒株。感染的病毒株通过测序峰图结果分析，ATT编码蛋白为HBcAg18-27I，GTT编码蛋白为HBcAg18-27V。

2.3 HLA-A2鉴定及HBV特异性CTL检测结果对15例HBcAg18-27V的SHB患者和随机挑选的22例HBcAg18-27I的SHB患者鉴定其 HLA-A2。HLA-A2阳性比率在HBcAg18-27V与HBcAg18-27I患者中相近(7/15 vs 8/22，P＞0.05)。在随访的患者中，2例HLA-A2阳性患者中，1例在发病时感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I混合病毒株，而在随访第48周时为HBcAg18-27I单一病毒株，此时对其PBMC进行五聚体染色显示HBcAg18-27V特异的记忆细胞频数为0.90%，而HBcAg18-27I特异的记忆细胞频数为0.07%;另1例在发病时感染HBcAg18-27I单一病毒株，在随访第68周时仍为HBcAg18-27I单一病毒株感染，此时对其PBMC进行五聚体染色显示HBcAg18-27V特异的记忆细胞频数为0.36%，而HBcAg18-27I特异的记忆细胞频数为0.13%。

3 讨论

HLA-A2限制性的表位HBcAg18-27V(FLPSDFFPSV)在HBV基因A、D型的患者中流行率高，而在HBV基因B、C型的患者中流行率仅为1.9%(3/ 160)和6.7%(7/105)［5，8］。在本研究中，HBcAg18-27V在SHB组明显高于CHB组，22例HBcAg18-27V患者中有1例为HBV基因D型，其余21例为B、C型。表明HBcAg18-27V在SHB中高流行，与HBV基因型不相关。而文献［4］报道，与HBcAg18-27I相比，HBcAg18-27V和HLA-A2分子有更好的亲和力，能诱导更强的细胞免疫反应;表明HBcAg18-27V这种表位形式参与了HBV感染相关的SHB。

在本研究中，我们随访了存活的 10例 HBcAg18-27V形式的SHB患者，其中4例HLA-A2阳性的患者发病时感染HBcAg18-27V或混合感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I病毒株，随访中均变异成HBcAg18-27I单一病毒株;而在5例HLA-A2阴性的患者中，发病时感染HBcAg18-27V或混合感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I病毒株，随访后仍能检测到包含HBcAg18-27V的病毒株。表明在HLA-A2阳性的患者中，HBcAg18-27V向HBcAg18-27I变异是免疫逃逸的结果。

仅有2例HLA-A2阳性患者分别于随访第48周和68周时收集到PBMC，其在发病时分别感染HBcAg18-27V、HBcAg18-27I病毒株和HBcAg18-27I单一病毒株;在随访第48周和第68周时均检测到HBcAg18-27I病毒株，HBcAg18-27V特异性记忆T细胞的频数高于HBcAg18-27I特异性记忆T细胞的频数。提示在长时间随访后，尽管HB-cAg18-27V病毒已检测不到，但患者体内仍保留着对HBcAg18-27V强而持续的免疫反应;而正是这种强的免疫反应介导了HBcAg18-27V病毒的清除，导致HBcAg18-27V向HBcAg18-27I发生表位漂移。

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