胰岛素对心肌缺血/再灌注损伤兔心肌组织中髓过氧化物酶活性的影响及意义

吴 峰，王国坤，倪飞华，冯金忠，邱一华，李 嘉，张海峰，高 峰，秦永文

(1第二军医大学附属长海医院，上海200433;2第四军医大学; 3解放军第九八医院)

心肌梗死与炎症反应密切相关，缺血/再灌注(MI/R)后心肌组织可出现较前损伤加重的情况，目前研究认为可能是循环血中的中性粒细胞(PMN)向血管内皮黏附，并最终迁移和聚集在缺血的心肌组织中，活化的PMN可释放大量的毒性物质，如H2O2、超氧阴离子及酶类物质等，从而加剧了心肌缺血再灌注(MI/R)［1，2］。胰岛素在临床危重症患者中应用后能够明显降低其败血症和脓毒血症的发生率［3］，研究［4］提示，胰岛素可能存在重要的抗炎作用。结合我们2008年以来的研究工作［5］，近期我们又观察了胰岛素是否能够通过抑制PMN在心肌组织中聚集而减轻局部及全身炎症反应，达到保护MI/R心肌的作用。髓过氧化物酶(MPO)活性是反应PMN聚集、浸润程度的重要指标，本研究通过检测心肌组织中的MPO活性反应PMN在局部心肌组织的浸润情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 健康新西兰大白兔(40只，由第二军医大学实验动物中心提供)，雄性，体质量2.5～3.0 kg。胰岛素为诺和诺德公司产品;肌酸激酶同工酶(CK-MB)、MPO、高敏C反应蛋白(hs-CRP)活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;伊文氏蓝和氯化三苯基四氮唑(TTC)购自Sigma公司。

1.2 模型制备和实验方案 用3%戊巴比妥钠行兔耳缘静脉注射麻醉(1 mL/kg)，心电图监测。切开实验兔皮肤，沿胸骨左缘开胸，剪开心包，暴露心脏，以无创针带单丝线在冠状动脉(冠脉)左旋支(LCX)中部穿过，线两端共套一聚乙烯管，形成闭合环，拉紧丝线，钳夹聚乙烯管即阻断LCX前向血流，心脏表面可见青紫，心电图出现ST段上升，松开闭环后心肌获得再灌注，青紫可减轻。出现以上情况认为结扎成功。缺血15 min后进行以下处理:将40只兔随机分为4组，各10只。假手术组:丝线通过冠脉后不收紧聚乙烯管(即不形成缺血);GIK组:通过另一侧耳缘静脉输注葡萄糖250 g/L+胰岛素60 U/L+氯化钾 60 mmol/L，4 mL/(kg·h);GK组:通过另一侧耳缘静脉输注葡萄糖250 g/L+氯化钾60 mmol/L，4 mL/(kg·h);对照组:通过另一侧耳缘静脉输注0.9%NaCl，4 mL/(kg·h)。本实验中，实验兔行缺血45 min、再灌注6 h处理。

1.3 各组血浆CK-MB活力和hs-CRP测定 于再灌注6 h时取各组兔动脉血(2 mL)，静置后4℃离心(2 500×g)10 min，采用分光光度法检测血浆CK-MB、hs-CRP。具体操作根据试剂盒说明书进行。

1.4 心肌梗死范围测定 实验兔再灌注6 h结束后，再次拉紧丝线，结扎LCX，并向左心室腔内注入50 mL的2%伊文氏蓝，立即取出心脏，－20℃冻存至心脏呈固体硬块状。垂直于心脏长轴将其切成约2 mm厚的薄片，单片置于含1%TTC(pH 7.4)2 mL的12孔培养皿中，37℃孵育15 min。用数码相机拍照，图像表现为伊文蓝染色区(非缺血区)、TTC染色区(红染，缺血但仍存活组织)以及非TTC染色区(梗死心肌)，将图像输入计算机，用SigmaScan面积测算软件进行计算分析。心肌梗死范围以每一心脏总梗死面积(INF)占总缺血区面积(AAR)的百分比表示。

1.5 心肌组织中MPO活性测定 心脏组织称重后，按质量体积比1∶19加匀浆递质制成5%的匀浆液，随后加入H2O2和显色剂，水浴后立即在分光光度计460 nm处测定吸光度值(A值)。MPO活性以37℃反应体系中H2O2被分解1 μmol为1个活力单位。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。组间数据比较用单因素方差分析(ANOVA)，若总体差异显著，再以SNK-q检验分析相应两组间的差异。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血浆CK-MB活性比较 GIK组、GK组、对照组、假手术组血浆CK-MB活性分别为(32.3± 2.8)、(120.2±11.4)、(89.5±11.1)、(123.5± 17.7)U/L;GIK组与对照组相比，P＜0.01;GK组与对照组相比，P＞0.05。

2.2 各组心肌梗死面积比较 GIK组心肌梗死范围为35.7%±2.7%、GK组为49.4%±2.6%、对照组为48.6%±3.2%、假手术组为9.2%±2.1%; GIK组与对照组相比，P＜0.01;GK组与对照组相比，P＞0.05。

2.3 各组心肌组织MPO活性比较 GIK组、GK组、对照组、假手术组MPO活性分别为(0.64± 0.12)、(1.05±0.14)、(1.15±0.16)、(0.21± 0.06)U;与假手术组相比，对照组MPO活性升高近6倍，两组相比，P＜0.01;GIK组与对照组相比，P＜0.01;GK组与对照组相比，P＞0.05。

2.4 各组血浆hs-CRP水平比较 GIK组、GK组、对照组、假手术组hs-CRP分别为(6.98±0.91)、(10.23±1.24)、(10.98±1.08)、(2.07±0.48) mg/L;GIK组与对照组相比，P＜0.01;GK组与对照组相比，P＞0.05。

3 讨论

研究［6］发现，胰岛素不仅具有调节糖、脂肪等各种营养物质代谢的作用，还具有稳定内皮细胞、抗炎和抗动脉粥样硬化等效应。关于胰岛素在MI/R中的作用机制，传统观点认为胰岛素通过代谢机制促进心肌细胞对葡萄糖的摄取和更有效的利用，增加缺血心肌的能量供应，间接发挥保护受损心肌的作用。研究［7］发现，胰岛素主要通过磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶—内皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eNOS)途径来激活细胞内的“生存信号”，从而减少心肌细胞的凋亡和坏死。同时，临床试验显示，在危重病患者中强化胰岛素治疗能够明显降低患者脓毒血症和败血症的发生率［8］。Chaudhuri等［9］发现，对急性ST段抬高的心肌梗死患者，胰岛素强化治疗能够同时降低血浆C-反应蛋白和淀粉酶A的水平。

心肌组织发生缺氧、坏死后引起炎性反应，释放活性分子和化学因子，同时表达内皮细胞黏附分子，促使PMN与心脏冠脉内皮细胞发生黏附，并渗透血管内皮在心脏受损组织中聚集，最终将释放大量的活性氧自由基和分泌各种水解酶类，直接对心脏组织造成损害［2，3］。其中，PMN在心脏局部的黏附和浸润是炎症反应的起始，亦是随后发生炎性损伤的重要过程，对这一反应的抑制将会减轻MI/R过程中的炎性损伤。鉴于MPO是PMN激活后释放的一种主要酶类，其可以作为反映局部PMN活性的一个标志。在本研究中，我们观察到进行胰岛素干预治疗后可降低MI/R兔心肌组织MPO活性，即减少PMN在受损心肌组织中的浸润、积聚。通过抑制PMN积聚使CK-MB水平下降、心肌梗死面积减小，这可能是胰岛素发挥心脏保护作用的途径之一。

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