明胶酶检测方法研究进展

陈秋凤,周防震

1.湖北民族学院附属医院(湖北 恩施 445000)2.湖北民族学院生物科学与技术学院(湖北 恩施 445000)

明胶酶，亦称Ⅳ型胶原酶[1]、基底膜性胶原酶[2]等，属于基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)范畴，包括明胶酶A(MMP-2或称72kDaⅣ型胶原酶)和明胶酶B(MMP-9或称92kDaⅣ型胶原酶)，可降解Ⅳ型胶原、明胶和V型胶原等基底膜成分，在组织炎症[3]、纤维化[4,5]、免疫[6]与肿瘤转移[7～9]等诸多过程中发挥重要作用。明胶酶检测方法从最初的明胶酶谱法到现在采用的ELISA法，从粗略定性到逐渐发展为准确定量，方法稳定性、可靠性逐渐完善，操作也变得更为简单。本文就明胶酶测定方法的研究进展进行综述。

1 基于明胶酶催化活性的检测方法

利用明胶酶能催化降解明胶的特点发展建立起来的检测方法主要有明胶酶谱法(Zymography)、荧光明胶酶法和DQ明胶(Dye-quenched-gelatin)原位酶谱法。

1.1明胶酶谱法Kleiner等[10]于1994建立此方法，是一种基于非还原SDS-PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法。主要原理是：1)含明胶酶的样本首先上样进行非还原SDS-PAGE电泳，利用明胶酶与阴离子去垢剂SDS结合，形成蛋白质-SDS复合物，使待测蛋白质带上相同的负电荷，其量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，此时蛋白质分子在凝胶中的迁移率取决于其分子质量大小；2)SDS-PAGE电泳后利用含阳离子去垢剂(Triton-x 100)的洗脱液洗脱去除SDS，这一过程中引发了明胶酶酶原蛋白体外活化机制，酶原在凝胶内除掉一个约10 kDa的小肽，转变为有活性的酶[11]，降解凝胶中相应部位的明胶。已经被激活的明胶酶在去除SDS后也可以恢复酶活性[12]；3)然后经过短暂漂洗后将凝胶放入孵育液中进行孵育，这时明胶酶分解凝胶中的底物明胶；最后进行显色、脱色后可见蓝色背景下的白色条带。该方法系最早建立的明胶酶检测方法，是目前最为常用的明胶酶检测方法，分为酶原和活化型酶两种形式，费用低、简便、敏感，适合血浆、组织细胞蛋白提取物或细胞培养上清等多种形式样本的分析，但只能半定量分析MMPs活性，且需要组织匀浆或血清分离等过程，容易导致蛋白降解及部分酶活性丢失，也无法进行组织定位观察。

1.2 EnzChek荧光明胶酶检测法Molecular Probes公司于2001推出此方法，是用荧光胶体偶联物代替普通明胶而建立起来的一种方法。主要检测要点是：1)获得含明胶酶的样本；2)含胶原酶的样本与荧光胶体偶联物DQ-明胶共孵育，样本中的明胶酶分解荧光明胶，释放荧光肽，荧光的增加量与样本中明胶酶的活性成正比，利用荧光光度计结合标准曲线即可定量确定明胶酶的量。该方法将明胶酶的活性与化学发光技术巧妙结合，具有高敏、快速、方便和直观等优点，适合多种形式样本的分析，特别是适合明胶酶活性抑制剂的高通量筛选。但缺点在于试剂盒费用高，且操作过程中仍然需要组织匀浆或血清分离等过程，且无法进行组织定位观察。

1.3 DQ明胶原位酶谱法该方法既综合了传统明胶酶谱法和EnzChek荧光明胶酶检测法两种方法的优点，又克服了形态定位缺乏之不足，是建立在冰冻切片基础上进行的明胶酶活性分析方法。主要检测要点是[13]：1)制备组织超薄冰冻切片；2)制备10 g/L的琼脂糖液，4℃放置备用；3)10 g/L的琼脂糖液于100℃温浴至液体析出，吸出琼脂糖析出液；4)利用琼脂糖析出液10倍稀释1 kg/L 的DQ-明胶，充分混匀；5)每片组织超薄冰冻切片滴加50 μL DQ-明胶/琼脂糖析出液混合液，4℃避光5 min；6)将组织超薄冰冻切片置于反应液中，37℃避光孵育8～24 h；7)PBS洗涤和荧光显微镜下检测观察。

2 基于明胶酶抗原性的检测方法

明胶酶具有大分子蛋白的共性——抗原性，利用此特性发展建立起来的基于抗原抗体特异结合的明胶酶检测体系包括免疫组化分析、Western blot分析和ELISA分析。

2.1免疫组化分析法该方法是迄今原位检测组织蛋白最直观、应用最广的方法，在检测明胶酶蛋白的试验中，它不仅可以提供各种肿瘤间、各种因子间半定量的比较数据，更重要的是能象DQ明胶原位酶谱法一样做到组织定位，从而能够从形态学上反映明胶酶的表达规律。田鲲等[14]利用免疫组化的方法，发现黏液表皮样癌中明胶酶主要表达在表皮样细胞和中间细胞，黏液细胞着色少；腺样囊性癌中，条索状实性区域上皮细胞表达明胶酶强于腺管-筛孔样区域，从而认为黏液细胞分化相对成熟，而表皮样细胞和中间细胞分化较低，显示较强的侵袭活性。但是由于实验中主观因素干扰较多导致实验稳定性较差，如阳性信号的强弱容易受室温、空气湿度、溶液离子浓度等因素的影响，各批次着色程度也存在较大差异，另外阳性判断也因主观认识不一而有所差异。该方法稳定性差、不能准确定量比较，从而限制了其普遍的应用。

2.2 Western blot分析收集含明胶酶样本(细胞培养液或组织细胞蛋白提取液)，经SDS-PAGE电泳后，转移到NP膜或者PVDF膜，封闭，与一抗(抗MMP-2或MMP-9抗体)及二抗(HRP标记)依次孵育，利用ECL试剂盒对反应产物进行检测[15～17]。Western blot分析法，特异性强，灵敏度高，选择合适内参可以准确定量，结果可靠，但是成本较高，需要购买抗MMP-2或MMP-9抗体、内参抗体以及二抗，同时检测费时费力，且一次检测的通量有限。

2.3酶联免疫吸附分析(ELISA) ELISA分析法综合了Western blot分析法特异性强、灵敏度高和可定量的优点，同时兼有操作简单，获得结果快，检测成本低等特点，使测定达到很高的灵敏度和稳定性，尤其适合大批量样本中明胶酶的检测，以及靶向明胶酶的药物抑制剂的高通量筛选。但该方法需要价格昂贵的酶标仪等多孔板读板仪。

3 结论与展望

从Kleiner1994年建立明胶酶谱法到现在，明胶酶的测定方法伴随分子生物学分析技术进步而不断更新，目前已有基于明胶酶催化活性和抗原性两大类6种方法可供选择。各种方法侧重点不尽相同，免疫组织化学和DQ-明胶原位酶谱法重点在蛋白的组织定位和半定量；EnzChek荧光明胶酶检测、Western blot和ELISA几种方法在严格控制实验条件的前体下可以做到蛋白定量检测，而明胶酶谱法则能够区分酶原和活化酶。若综合考虑实验设备、技术手段和经费预算等多方面因素，最常用的还是明胶酶谱、荧光明胶酶检测和免疫组化三种方法。ELISA测定明胶酶的方法，具有快速，高通量和可以准确定量等优点，可以动态检测组织炎症、肿瘤等发生、发展过程中明胶酶的变化，以及患者在治疗过程中明胶酶的变化，将成为临床早期诊断、治疗和预后的重要检测手段。

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