原发性肝癌患者外周血CD105阳性细胞的测定及其意义

陈霞 刘蕾 牛国超 梁育飞 张晓岚

肝硬化被视为原发性肝癌(HCC)的一种癌前疾病。肝癌的筛查方法包括血清甲胎蛋白(AFP)检测、B超及放射学检查等，但是AFP检测对肝癌诊断的阳性率差别很大。CD105是一种增生相关内皮细胞的细胞膜抗原。CD105参与了血管生成的某些过程，因此可以将CD105作为肿瘤新生血管标记物。CD105参与血管生成，是新生血管的标志，因此，可以预见CD105在恶性肿瘤的诊断、治疗和预后中发挥重要的作用。HCC患者外周血CD105阳性细胞的测定及在预测HCC的价值笔者尚未见报道。本研究通过检测外周血CD105阳性细胞和血清AFP在肝硬化及HCC患者的表达水平，探讨HCC患者与肝硬化患者及正常对照间外周血CD105阳性细胞表达的差异及其意义，判定CD105在肝硬化肝癌早期诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 纳入标准:①肝硬化病例均符合2000年9月西安中华医学会传染病与寄生虫病学会分会、肝炎后肝硬化诊断标准;②HCC患者符合2001年9月第八届全国肝癌学术会议通过的原发性肝癌的临床诊断与分期标准;③临床资料齐全，包括肝功能、凝血常规检测，B超或CT影像学检查。

1.1.2 排除标准:①合并其他部位肿瘤;②风湿免疫性疾病［1］;③妊娠女性;④心肌梗死急性期［1］。

1.1.3 病例资料 选取沧州市中心医院住院肝硬化患者60例为肝硬化组，男44例，女16例;平均年龄(55±12)岁。HCC患者40例为HCC组，男30例，女10例;平均年龄(54±8)岁。另外，选取健康志愿者30例作为正常对照组，男14例，女16例;平均年龄(59±10)岁。

1.2 方法

1.2.1 标本采集:清晨空腹抽血后，样本分送CD105和AFP检测。

1.2.2 CD105 测定:抽取抗凝静脉全血 1 ml，取其中 100 μl全血置于一试管中，加入 20 μlγ1 对照液，后加入 20 μl CD45;另取一试管 100 μl全血，加入 20 μl CD105，再加入 20 μl CD45，随后2管避光放置20 min，各加入溶血素1 ml，再避光放置10 min，以1500 r/min的速度离心5 min，弃上清液，各加缓冲液2 ml，同一速度再次离心5 min，弃上清液，再加入400 μl缓冲液后上机，用流式细胞仪检测，以Cell Quest软件获取分析数据，定量分析每管样品中10 000个细胞，以CD105+细胞为阳性细胞，收集数据，计数阳性细胞的数目，判定结果。检测外周血中CD105阳性细胞的表达率。

1.2.3 AFP测定:采用微粒子捕捉免疫发光技术(MEIA)，酶标抗体采用碱性磷酸酶(ALP)作为标记物，取血清的上清液1 ml，置于测量杯中，仪器自动吸取样品 50 μl，液相试剂250 μl，固相试剂 250 μl，37℃ 温水浴 7.5 min，冲洗后，自动加入反应试剂(碱性双氧水)，激发反应，其发光强度与样品浓度成正比。直接读取结果。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，多组间均数差异性比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC患者外周血CD105阳性细胞变化 HCC组外周血CD105阳性细胞水平高于肝硬化组与正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。肝硬化组外周血CD105阳性细胞水平高于正常对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 3组CD105阳性细胞的表达%，±s

表1 3组CD105阳性细胞的表达%，±s

注:与HCC 组比较，*P ＜0.05

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2.2 HCC患者外周血CD105阳性细胞的测定与血清AFP水平比较 HCC患者的血清AFP的表达水平较肝硬化组和正常对照组升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。其中AFP＞400 ng/ml的HCC患者外周血CD105阳性细胞水平显著高于AFP＜400 ng/ml者，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2、3。

表2 3组血清AFP的表达ng/ml，±s

表2 3组血清AFP的表达ng/ml，±s

注:与HCC 组比较，*P ＜0.01

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表3 不同AFP等级的肝癌中CD105阳性细胞比例与肝硬化的比较%，±s

表3 不同AFP等级的肝癌中CD105阳性细胞比例与肝硬化的比较%，±s

注:与HCC AFP＜400 ng/ml组比较，*P ＜0.01;与肝硬化组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01

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2.3 HCC患者外周血CD105阳性细胞的水平与肿瘤大小的关系 肿瘤直径＞5 cm的患者外周血CD105阳性细胞水平高于肿瘤直径≤5 cm患者，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表4。

表4 不同等级直径肝癌CD105阳性细胞的表达比例%，±s

表4 不同等级直径肝癌CD105阳性细胞的表达比例%，±s

注:与直径≤5 cm比较，*P ＜0.01

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3 讨论

HCC是一种发病率及病死率均很高的恶性肿瘤。早期诊断、早期治疗才能延长肝癌患者的生存期，肝癌缺乏特异的临床表现，早期诊断率低，许多患者诊断时已发展为进展期肝癌。目前临床上常用的肝癌早期筛查手段是AFP检测、B超和影像学检查等。AFP是目前诊断肝癌最常用的血清学指标，AFP的特异性较高，但敏感性不高，因此，寻找一个敏感性更高的血清诊断学指标对提高早期诊断率有一定帮助。

CD105是血管内皮细胞上可以结合转化生长因子-β(TGF-β)的受体蛋白，是由2个相对分子质量约为9.5万的单体聚合而成。有学者［2］发现了主要定位于各组织血管内皮细胞的endoglin，并且在众多正常组织间质的血管内皮细胞和体外培养的血管内皮细胞上检测到CD105。近几年检测肿瘤组织中新生血管内皮表面的TGF-β受体，使得CD105与肿瘤的生长和预后密切相关。CD105的存在，为提纯内皮细胞或为来源于内皮细胞的肿瘤分类提供了一个可能有效的方法［3］。

CD105能调节内皮-间质间的信号传递，参与血管新生过程，而血管新生是肿瘤普遍存在的特征，与肿瘤组织的浸润、转移密切相关。在不同组织来源的恶性肿瘤中，CD105在肿瘤组织及其周围血管的内皮细胞中高表达［4］，且CD105主要在未成熟的血管内皮表达，少数情况下可在肿瘤细胞中弱表达［5］，进一步的研究表明，Endoglin无论在体内和体外都过表达新生的血管内皮细胞，并与增殖指标cyclin A、ki-67过表达直接相关，是血管内皮细胞增殖的标志，与内皮细胞标志物如CD31、CD34、Ⅷ因子相关抗原等相比，CD105阳性细胞仅在新生的血管内皮细胞上高表达，而在正常组织的血管上无表达或弱表达［6，7］。

肝癌是一种富含血管的肿瘤，血管形成是肝癌生长、浸润与转移的重要条件。Takahashi等［8］发现，直肠癌、乳腺癌等发生转移的患者血清S-CD105的表达水平显著高于未发生转移的患者，并发现化疗能降低血清S-CD105的含量，从而提出血清S-CD105作为血管生成的标志，可以用来预测恶性肿瘤患者疾病复发、转移的危险性。Akagi等［9］研究发现，在结直肠腺瘤由轻度、重度不典型增生至腺癌发展的过程中，CD105标记的MVD值逐渐升高，表明CD105在预测结直肠腺瘤癌变的过程中是有效指标，提示CD105有助于早期诊断疾病，及时治疗。

尽管存在着一定程度的假阳性及假阴性，AFP仍然是目前公认的肝癌最佳诊断标志物，在HCC早期诊断中具有重要价值。AFP是胚胎干细胞产生的一种特殊蛋白质，胎儿出生后不久即逐渐消失，是目前应用最广泛的早期诊断和筛查肝癌的指标，但其敏感性和特异性均存在不如意地方，尤其是血清中AFP水平与肿瘤大小呈正相关，对小肿瘤不敏感，限制了其在肝癌早期诊断中的价值［10］。于兴等［11］报道，有27.7%的良性肝病患者血清AFP水平升高。

在乙型肝炎——肝硬化——肝癌的发展过程中，乙肝病毒通过整合到宿主的DNA中，促进血管生成。在恶性肿瘤形成中，TGF-β主要起到了促增殖作用。CD105通过激活TGF-β/ALK1信号传导途径，同时间接抑制TGF-β/ALK5信号传导途径，促进血管内皮细胞增殖，导致肿瘤血管生成。在肿瘤缺血缺氧时，内皮细胞开始裂解血管内皮细胞细胞膜上的CD105，释放可溶性CD105，使原有肿瘤部位的血管内皮受损，内皮细胞间的连接松散、扩大，可使肿瘤细胞更好的释放入血，进而远处转移。本研究发现HCC患者外周血CD105阳性细胞的水平显著高于肝硬化组及正常对照组，考虑与以下因素有关:(1)肝癌患者TGFβ1过度调节及CD105在有活性的肝脏星状细胞表达;(2)CD105在内皮细胞中过表达，而内皮细胞在肿瘤发生发展过程中至关重要，起着决定性作用。

AFP是由胚胎期卵黄囊和肝细胞产生的糖蛋白。肝癌患者体内AFP基因重新表达，其表达的调控主要发生于转录水平。大多数肝癌患者血清AFP显著升高，但仍有10% ～30%的患者呈阴性。AFP必须联合影像学才能诊断肝癌，但是AFP联合影像学诊断也仍有一定的漏诊率。本研究发现HCC患者外周血CD105阳性细胞的表达显著高于肝硬化患者;AFP＞400 ng/ml的肝癌患者外周血CD105阳性细胞的表达水平显著高于 AFP＜400 ng/ml者;AFP＜400 ng/ml的患者外周血CD105阳性细胞的表达显著高于肝硬化组，提示CD105可能作为AFP不满足诊断标准的肝癌患者补充诊断指标。

本研究发现外周血CD105在肝硬化进展为肝癌过程中的关系紧密，这也从侧面反映了血管生成在肝癌发生发展过程中的重要性。我们通过分析发现外周血CD105阳性细胞和AFP联合检测可提高肝癌的阳性检出率，减少漏诊率，提高诊断的准确性。

恶性肿瘤的生长依赖于营养血管的不断生成。一旦肿瘤直径超过2 mm，就有毛细血管的生成，使肿瘤获得足够的血供和营养。肿瘤新生血管结构缺乏完整性，管壁薄弱，更容易被肿瘤细胞穿透，而且肿瘤呈膨胀浸润性生长，会对周围组织产生压力，这样可使肿瘤细胞更容易进入血液循环，形成转移灶。随着肿瘤体积的增大，新生血管形成更多，更容易复发转移。由于CD105在恶性肿瘤中的表达可以反映出肿瘤血管生成和内皮细胞活跃情况，所以CD105的高表达可作为恶性肿瘤患者转移和预后判断的指标之一。有远处转移的肝癌患者外周血CD105阳性细胞的水平显著高于无远处转移者，分期越晚，外周血CD105阳性细胞的水平越高。本研究发现肿瘤直径＞5 cm的肝癌患者外周血CD105阳性细胞的水平高于肿瘤直径＜5 cm的肝癌患者的CD105阳性细胞的水平。肿瘤的局部复发率随体积的增大而增加，发生远处转移的机会亦越多。推测外周血CD105阳性细胞的水平升高可能与肝癌患者肿瘤复发与转移有一定的关系，很可能对预测肝癌复发、转移有一定价值，尚需扩大样本量进行进一步研究。

CD105在肿瘤发生发展过程中起着重要作用，同时也与肿瘤的预后有关。CD105在HCC的诊断与治疗方面起着重要作用，在靶向治疗肿瘤的今天，CD105展现出了一定的临床应用前景。

1 Li CG，Wilson PB，Bernabeu C，et al.Immunodetection and characterisation of soluble CD105 TGF-beta complexes.JimmunolMethods，1998，218:85-93.

2 Quackenbush EJ，Letarte M.Identification of several cell surface proteins of non-T non-B acute lymphoblastic leukemia by using monoclonal antibodies.J Immun，1985，134:1276.

3 Westphal JR，Willems HW，Schalkwijk CJ，et al.Characteristics and possible function of endoglin，a TGF-beta binding protein.Behring Inst Mitt，1993，92:15.

4 Li SL，Gao DL，Zhao ZH，et al.Correlation of matrix metallopro-teinase suppressor genes RECK，VEGF，and CD105 with angiogenesis and biological behavior in esophageal squamous cell carcinoma.World J Gastroenterol，2007，13:6076-6081.

5 Yu D，zhuang L，Sun X，et al.Particular distribution and expression pattern of endoglin(CDl05)in the liver of patients with hepato-cellular carcinoma.BMC Cancer，2007，7:122.

6 Miller DW，Gaulich W，Karges B，et al.Elevated expression of endoglin，a component of the TGF-beta-receptor complex，correlates with proliferation of tumor endothelial cells.Int J Cancer，1999，81:568-572.

7 Li DY，Sorensen L K，Brooke BS，et al.Defective angiogenesis in mice lacking endoglin.Science，1999，284:1534.

8 Takahashi N，Kawanishi Tabata R，Haba A，et al.Association of serum endoglin with metastasis in patients with colorectal，breast，and others olid tumors，and suppressive effect of chem.Other apyon the serum endoglin.Clin Cancer Res，2001，7:524-532.

9 Akagi K，Ikeda Y，Sumiyoshi Y，et al.Estimation of angiogenesis with anti-CD105 immunostaining in the process of colorectal cancer development.Surgery，2002，131:109-113.

10 Arrieta O，Cacho B，Morales ED，et al.The progressive elevation of alpha fetoprotein for the diagnosis of hepato cellular carcinoma in patients with liver cirrhosis.BMC Cancer，2007，8:28.

11 于兴，胡章华.HCC甲胎蛋白阴性误诊84例分析.中国误诊学杂志，2003，3:1317.