P53、P63在原发性肝细胞癌的表达及临床意义

巴雅尔 张生彬 佟豪

原发性肝细胞癌(HCC)是人体常见的恶性肿瘤之一，我国HCC发病率很高，其病死率居消化道肿瘤前列，其中肝癌浸润、肝内及门静脉转移是其预后不良及患者死亡的主要原因。近年来，随着分子生物学技术的不断进步，对HCC发病机制的研究也逐步深入。肝癌的生成涉及许多基因的变化，基因变化的积累引起控制细胞生长和分化机制的紊乱，各种基因参与细胞增殖、凋亡和DNA复制等过程，其表达的失控最终导致HCC的发生和发展。本研究应用免疫组织化学方法检测肝癌组织、肝硬化、正常肝组织中P53、P63的表达，探讨P53、P63与原发性肝癌临床病理特征的关系以及两者之间的相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料 2005年9月至2010年9月我院普外科肝癌患者手术切除的标本46例，另选肿瘤旁肝硬化组织包埋蜡块20例和肝良性病切除肝组织12例作为对照组，4 μm厚度切片待测。其中肝癌患者52例，男37例，女15例;年龄21～72岁。所有病例均经术后病理证实。P53一抗鼠人单克隆抗体，P63一抗鼠抗人单克隆抗体，浓缩型，工作浓度1∶50，EliVisionTM plus试剂盒，SP法即用型免疫组织化学二抗试剂盒，DAB显色剂(DAB-0031)等均购自福建迈新生物技术有限公司。

1.2 方法 应用免疫组化法检测:全部标本取材后均常规用甲醛固定、石蜡包埋，制成4 μm连续切片后，进行免疫组EliVisionTM plus法染色，主要步骤:切片脱蜡至水，高压修复1.5 min，阻断内源性过氧化物酶20 rain，正常非免疫血清封闭30 rain，滴加1抗在室温孵育1 h，滴加50 μl聚合物增强剂A，室温孵育20 rain;滴加50 μl酶标抗鼠/兔聚合物B，室温孵育30 min;新鲜DAB显色，苏木素复染。以已知阳性反应片作阳性对照，阴性对照采用PBS替代一抗进行同步染色。

1.3 判定标准 显微镜下随机选取4个高倍视野共记录200个肝癌细胞，(1)按显色组织所占的面积比例评分:(无阳性细胞或≤5%为0分，5% ～25%计为1分，26% ～50%计为2分，＞50%计为3分);(2)同时对染色强度进行评分:(0分为无染色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色);每例标本的积分为［(1)+(2)］/2，按积分高低分为:0分为阴性(－)，0.5～1分为弱阳性(+)，1.5 ～2 分为阳性(++)，2.5～3分为强阳性(+++)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，定性资料率的比较用χ2检验，非参数检验应用spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P63表达检验结果 P63在HCC组织中的阳性表达30例，呈弥漫性表达，主要位于细胞核，在高倍镜下可见显色主要位于核膜，呈棕黄色细颗粒状。表达率65.2%，其中6例呈(+)，13例呈(++)，11例呈(+++);肝硬化组织和正常肝组织中均未见表达，肝癌与癌旁肝硬化组织中P63蛋白的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=44.499，P=0.000)。HCC 中高分化组阳性表达率36.4%，中分化组阳性表达率68.2%，低分化组阳性表达率84.6%，差异有统计学意义(χ2=6.336，P=0.042);有淋巴结转移组阳性表达率80.8%，无淋巴结转移组阳性表达率45.0%，差异有统计学意义(χ2=6.376，P=0.012);而P63的阳性表达率与年龄、性别、肿瘤大小及有无门脉癌栓浸润无明显相关(P＞0.05)。见表1、2。

表1 P63在正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中的表达 例

表2 P63在肝癌中的表达与临床病理特点的相关性 例

2.2 P53表达检验结果 P53呈弥漫性表达，主要位于细胞核，在高倍镜下可见显色主要位于核膜，呈棕黄色细颗粒状。在肝癌、肝硬化及正常肝组织的阳性表达率分别是78.3%、10%和0，肝癌与癌旁肝硬化组织中P53蛋白的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=46.906，P=0.000)，其中10 例呈(+)，14例呈(++)，12例呈(+++);HCC中高分化组阳性表达率45.5%，中分化组阳性表达率86.4%，低分化组阳性表达率92.30%，差异有统计学意义(χ2=8.435，P=0.015);有门脉癌栓浸润组阳性表达率100%，无门脉癌栓浸润组阳性表达率33.3%，差异有统计学意义(χ2=22.634，P=0.000);有淋巴结转移组阳性表达率96.2%，无淋巴结转移组阳性表达率55.0%，差异有统计学意义(χ2=8.964，P=0.003);而 P53 表达率与年龄、性别及肿瘤大小无明显相关(P＞0.05)。见表3、4。

表3 P53在正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中的表达 例

表4 P53在肝癌中的表达与临床病理特点的相关性 例

2.3 HCC中P53与P63蛋白表达的相关性 HCC中P53与P63蛋白表达无相关性(r=0，P=0.895)。见表5。

表5 HCC中P53与P63蛋白表达的关系 n=46，例

3 讨论

近年来迅速发展的蛋白质组学研究，能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中全部蛋白质种类和数量的变化，对于探讨疾病机制、寻找疾病诊断的特异性标志物和药物治疗的靶标来说，是一种有效的高通量的研究模式，可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物、新关键分子，极大地丰富诊断标志物的选择组合及复杂致病机制的全面阐明。

P53是一种重要的抑癌基因之一，在人类多种肿瘤细胞中可发生突变［1］，P53基因的突变产物P53蛋白是一种肿瘤促进因子，它的集聚与HCC的增殖和进展密切相关，以免疫组化法检测到的P53蛋白都是这种突变型产物。突变或野生型P53基因，由作为一种转录因子或成形其他蛋白质复合物在细胞生长，分化和凋亡中起着重要作用，此外，P53基因失去功能与细胞分化低，预后差相关。本实验研究中，P53在肝癌组织中有较高的阳性表达，证实了HCC组织中P53蛋白过表达是肯定的，P53可作为反应HCC生物学行为的重要指标。P53在癌旁肝硬化组织中有少量表达，可能与癌旁肝硬化的细胞常是增殖活跃的细胞有关，具体机制有待进一步研究。由本实验可知P53的表达随着肿瘤分化程度的降低及门静脉癌栓的形成而增高;与国内多数学者的结论相符［2］，表明P53蛋白参与肿瘤的发生发展过程，与肿瘤的不良生物学行为有关。而P53表达率与年龄、性别及肿瘤大小无明显相关(P＞0.05)。P53蛋白表达情况在一定程度上反映了肝癌细胞的增殖及恶性程度，已被研究证实在肝癌发生发展过程中发挥重要作用，因此，一个野生型P53基因的恢复是一个吸引人的抗癌治疗策略［3］。

P63基因是新近发现的P53的同源基因，属P53家族的成员之一，由于在结构上具有相同区域，能激活P53的相关靶基因，引起细胞凋亡和细胞周期的停滞，认为与P53一样是候选的抑癌基因。深入研究发现P63具有独特的SAM区，它在调节细胞分化、增殖方面有重要的作用。P63基因并不是像P53基因那样发生广泛的突变，而去除P63基因的小鼠也并不像去除P53基因的小鼠那样表现出肿瘤易感性，这些提示它并不是一个经典的抑癌基因［4］。P63基因在人多种肿瘤中的分析表明，P63更为普遍的表现为表达的异常，不是基因突变［5］。本实验中原发性HCC的肿瘤细胞，是增生活跃、具备很强的增殖能力，因此P63在原发性HCC中见高表达，且明显高于肝硬化组织和正常肝组织，说明P63在HCC发生发展过程中发挥癌基因的作用，与原发性肝癌的发生、发展密切相关。本实验研究中，P63表达增高与HCC的肿瘤分化程度及有无淋巴结转移有关，说明P63的作用在肝癌形成的早期，起促癌作用。P63的阳性表达率与年龄、性别、肿瘤大小及有无门脉癌栓浸润无明显相关(P＞0.05)。研究表明P63基因与上皮源性肿瘤的发生发展关系较为密切，在人的恶性肿瘤尤其是鳞癌中，P63呈扩增趋势［6，7］，国内外对上皮源性肿瘤中P63的过表达研究较多，这与P63编码的活性产物，主要调节胚胎形成时期外胚层分化有关。在消化系肿瘤中P63也呈过表达［8］，P63基因转录、剪切后产生多种异构体，可诱导细胞周期停滞和细胞凋亡，抑制衰老等功能，与消化系肿瘤的发生、发展密切相关。

总之，对肝癌的分子生物学研究应该引起我们的重视，希望在肝癌基因类标志物研究的同时，更应推进肝癌蛋白类标志物的研究，进而提高肝癌的早期诊治水平，并作为诊断、预后判断和评价肿瘤生物学行为的客观指标，对指导临床采用基因治疗提供依据。

1 官成浓，廖湘晖，罗海清，等.P53基因与原发性肝癌临床特征的关系.临床肿瘤学杂志，2010，15:974-977.

2 官泳松，拉孜，贺庆，等.血清P53抗体、P53基因表达与原发性肝癌的分化程度.第二界中日肿瘤介入治疗学术会议论文集.2008.

3 Weng SY，Yang CY，Li CC，et al.Synergism between p53 and Mcl-1 in protecting from hepatic injury，fibrosis and cancer.J Hepatol，2011，54:685-694.

4 Osada M，Ohba M，Kawabara C，et al.Cloning and functional analysis of human P51，which structurally and functionally resembles P53.Nat Med，1998，4:839-843.

5 Nishi H，Isaka K，Sagawa Y，et al.Mutation and transcriptionanalysis of the p63 gene in cervical carcinoma.Int J Oncol，1999，15:1149-1153.

6 Yao JY，Pao CC，Chen JK.Transcriptional activity of TAp63 promoter is regulated by c-jun.J Cell Physiol，2010，225:898-904.

7 Shalom-Feuerstein R，Lena AM，Zhou H，et al.ΔNp63 is an ectodermal gatekeeper of epidermal morphogenesis.Cell Death Differ，2011，18:887-96.

8 钱海龙，贺夫林.P53和P63在胰腺肿瘤中的表达及意义.临床医学杂志，2006，26:81-84.