P-选择素、CD44V6的表达与乳腺癌转移的关系研究

黄秀英 唐福兴 李凤玲 齐磊岩 张颖 张素华

乳腺癌是危害女性健康最常见的恶性肿瘤之一，远处转移是危及患者生命的主要原因。P-选择素是细胞黏附分子选择素家族中的重要成员，P-选择素在肿瘤的转移过程中发挥了极为重要的作用。CD44是近年来研究较多的细胞表面黏附分子，是细胞与细胞、细胞与ECM相互识别和作用的分子基础［1］。虽然 P-选择素基因的高表达、CD44基因的变异型CD44V6的出现提示了恶性肿瘤转移的倾向。但两项指标在乳腺癌中的表达及其相互作用关系的研究笔者还鲜见报道。

1 材料与方法

1.1 材料 收集保定市第四医院病理科2000年1月至2010年5月手术切除的蜡块存档标本93例，患者全部为女性，术前未接受任何辅助治疗，所有病例的临床及病理资料完整。切除标本由2名病理医师做出详细的病理诊断，包括病灶的大小、病理组织学类型、组织学分级、淋巴结转移等情况。其中乳腺导管内癌(DCIS)25例，乳腺浸润性导管癌(IDC)68例，其中48例伴有淋巴结转移;癌旁正常乳腺组织17例(取自距离乳腺癌组织边缘5 cm以上)作为对照组。

1.2 病理检查 所有病理标本均经4%的甲醛液固定，石蜡包埋，常规制片，HE染色。采用S-P法进行P-选择素、CD44V6二种抗体免疫组织化学染色，浓缩型兔抗人P-选择素多克隆抗体，工作液浓度为1∶50，购自武汉博士德公司，即用型鼠抗人CD44V6单克隆抗体，为福州迈新生物技术开发有限公司产品。用已知阳性切片做阳性对照，用已知阳性的乳腺癌切片，以PBS代替一抗，作为阴性对照。胞质(P-选择素)及细胞膜(CD44V6)出现黄色至棕黄色颗粒为阳性，相应部位未出现黄色至棕黄色颗粒为阴性。

1.3 判断标准［2，3］每张切片选取5个高倍镜视野，每个高倍视野下随机计数100个细胞，阳性表达者呈黄色至棕黄色颗粒，计算出阳性表达的细胞所占的百分比。结果判断标准:着色细胞＜10%为阴性，≥10%为阳性。着色细胞为10% ～25%为(+);25% ～50%为(++);＞50%者为强阳性(+++)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P-选择素、CD44V6蛋白表达 P-选择素、CD44V6蛋白阳性标记呈黄色或棕黄色颗粒，P-选择素阳性标记位于细胞浆(图1、2)，CD44V6 蛋白阳性标记位于细胞膜(图3、4)。P-选择素、CD44V6蛋白在DCIS组和IDC组的阳性率和强阳性率均明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。CD44V6在DCIS组的强阳性表达率明显低于IDC组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

图1 P-选择素(+++)定位于细胞质(SP×100)

图2 P-选择素(+++)在导管原位癌中的表达(SP×100)

图3 CD44V6(+++)定位于细胞膜(SP×400)

图4 CD44V6(+++)在浸润性导管癌中的表达(SP×40)

表1 P-选择素、CD44V6蛋白表达情况 例(%)

2.2 乳腺IDC中P-选择素、CD44V6蛋白表达与临床病理特征的关系 P-选择素、CD44V6蛋白与淋巴结转移组与无淋巴结转移组及不同分化程度间的差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 乳腺IDC中P-选择素、CD44V6蛋白表达与临床病理特征的关系例(%)

2.3 P-选择素与CD44V6蛋白表达的相关性 P-选择素呈阳性表达的83例乳腺癌中有74例CD44V6呈阳性表达;P-选择素呈阴性表达的10例中有6例CD44V6也呈阴性表达。两者存在明显的正相关(χ2=15.942，r=0.414，P＜0.01)。

3 讨论

P-选择素属选择素家族的重要成员，亦称 P-选择蛋白、CD62P、颗粒膜蛋白140(granule membrane protein，GMP-140)或血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白(platelet activation dependent granule external membrane protein，PADGEM)。P-选择素是一种由789个氨基酸残基构成的相对分子质量为140KD的跨膜糖蛋白。其染色体定位于1q21-24［4］，其结构可以分为5个区域:(1)3个区域共同构成了N末端的胞外区，即1个凝集素样区、一个表皮生长因子样区和9个补体调节蛋白重复单位。(2)C末端的24个氨基酸组成跨膜区。(3)35个氨基酸组成胞浆短尾区，P-选择素的胞外凝集素样区域是识别并结合其相应的配体的功能部位［5］。

P-选择素在静息状态下存在于血小板的α颗粒及内皮细胞的W-P小体中，其表面无P-选择素表达或呈持续低表达状态。在病理情况下，血小板及内皮细胞被某些成分(如LPS、组胺、血栓素、过氧化物、蛋白激酶 C、补体系统、ADP、TNF-α、ILlβ、LPS、TNF-α等)刺激而激活，P-选择素可出现异常表达。选择素有很多种配体，P-选择素能与其配体PSGL-1呈高亲和力结合，有报道不同阶段的黑色素瘤患者血浆中P-选择素均高于正常人，且与病情发展呈正相关［6］。Nair等［7］在食道癌患者的血浆中也检测出P-选择素的含量是升高的。Iwamura等［8］首先发现胰腺癌细胞(SUIT-2)中有P-选择素的表达，P-选择素的高表达还出现在胃癌、肾癌、肺癌、胶质瘤及卵巢恶性肿瘤中。Renkonen等［9］发现乳腺癌原发灶的癌细胞P-选择素的表达明显高于正常乳腺上皮细胞的表达。Fox等［10］也发现P-选择素在浸润性乳腺癌组织中的表达是增强的。Peeters等［11］注意到P-选择素的高表达也与结肠直肠癌的恶性程度有关。周同等［12］在60例胃癌的研究中发现P-选择素的过度表达与其分化程度无关系;与肾癌、卵巢恶性肿瘤的组织学类型无关;与胃癌、肾癌、肺癌、胶质瘤及卵巢恶性肿瘤患者的性别及发病年龄也无关;Caine等［13］发现乳腺癌特别是伴有转移的乳腺癌患者的血小板黏附性增高，此改变与P-选择素有关。且P-选择素单抗对肿瘤转移有抑制作用。结合我们的实验与上述报道发现，P-选择素基因过度表达的现象出现于多种组织和类型的恶性肿瘤中，P-选择素的过表达可能与乳腺癌的演进有关。乳腺癌P-选择素基因呈现异常表达的亚克隆细胞群，通过其自身表达P-选择素而上调血管内皮细胞和血小板P-选择素的异常高表达，从而在癌细胞与脉管间出现双重介导作用。最终导致乳腺癌发生淋巴结转移，也使临床TNM分期增高。提示P-选择素有可能成为较好的具有高转移倾向的乳腺癌预测指标和术后复发的监测指标。

人类CD44基因是由Dalchau等［14］于1980年用单克隆抗体技术检测并最先发现，该基因定位于11号染色体短臂上(11P13)，CD44分子分2类:(1)标准型CD44(CD44S)，仅由组成型外显子编码而成，其分子量为80～90 kDa。(2)变异型CD44(CD44V)，目前已发现有十几种CD44V。这种不同的拼接方式使得其分子量范围较大80～230 kDa。CD44基因是黏附分子家族成员之一，其编码的产物是由胞外、跨膜及胞质3个部分构成的跨膜糖蛋白，胞膜外区是CD44分子发挥生物学功能的重要结构。其主要功能:(1)参与淋巴细胞的激活，调节免疫功能。参与细胞间、细胞与ECM的黏附;(2)介导淋巴细胞在血液和淋巴液间运行、并将淋巴细胞归还到淋巴组织(淋巴细胞归巢)，故CD44又称归巢受体;(3)参与免疫调节，以及淋巴细胞的激活过程;(4)能够与细胞骨架蛋白结合，参与细胞的伪足形成及迁移运动;(5)CD44可在不同水平被调节，参与肿瘤的侵袭和转移。

Hofmann等［15］用Notherm印迹法研究了多个体外培养的人癌细胞系，在肺癌、膀胱癌、食道癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、宫颈癌和非何杰金淋巴瘤、结肠癌等中发现有CD44V表达。Sinn等［16］研究表明，CD44V6表达与大鼠乳腺癌组织学分级有关。Liu等［17］应用免疫组化检查了胃腺癌和结肠直肠腺癌各62例，发现CD44V6与对照组相比只在癌组织中表达，CD44V6的高表达与病理分级、浸润程度有关。Yamamichi等［18］进一步对CD44在多种脏器恶性肿瘤的研究认为CD44V5、CD44V6的表达与肿瘤进展程度关系密切。Matsumura等［19］在1992年首次应用杂交法证实乳腺癌组织中CD44过表达，认为CD44表达与乳腺癌预后有关。结果显示，CD44V6在乳腺导管内癌与导管浸润癌的蛋白表达均明显增强，随着CD44V6的蛋白表达增强，导管内癌的侵袭能力增加而演变成导管浸润癌。我们的结果支持了CD44V6与恶性肿瘤的转移及临床分期相关的结论。CD44V6的表达与乳腺癌原发灶的大小和患病年龄无关。认为肿瘤转移可能与CD44S和CD44V的表达失衡有关。CD44S丢失提示细胞间黏附能力减弱，恶性瘤细胞易于浸润。也有提出肿瘤细胞表达的过量CD44与间质的透明质酸相互作用促使其扩散而侵入血管或淋巴管，CD44V6高表达的癌细胞可能获得淋巴细胞样的“伪装”，逃避人体免疫系统的识别和杀伤，更容易进入淋巴结，继而导致转移。

关于P-选择素与CD44两者相互作用的机制，本结果显示，P-选择素呈阳性表达的83例乳腺癌中有74例CD44V6呈阳性表达，两者呈明显的正相关关系(r=0.414，P＜0.05)。研究发现，在结肠癌细胞系LS174T细胞表面的CD44V是一个类似P-选择素配体PSGL-1的功能性配体，其结合的位点也类似于PSGL-1［6］。结合上述报道推测:(1)过度表达CD44V6的乳腺癌细胞，容易与ECM黏附并通过改变细胞骨架蛋白的构型，参与细胞伪足的形成，促进细胞侵入脉管壁;(2)P-选择素的高表达，使侵入脉管的癌细胞很快与血小板结合形成瘤细胞栓子;(3)而P-选择素与CD44V6两者协同作用，使癌细胞获得淋巴细胞样的伪装，瘤细胞栓子的形成与淋巴细胞样伪装的获得，似一封闭的载体协助癌细胞逃避了机体的免疫杀伤作用，完成血液与淋巴液之间的循环，并归巢于淋巴结，最终使得淋巴结转移成为可能。

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