复方玄驹片微生物限度检查的方法学验证

(浙江省绍兴市食品药品检验所，浙江 绍兴 312071)

复方玄驹片以蚂蚁为主药，佐以淫羊藿、枸杞子、蛇床子等药，具有温肾、壮阳、益精、祛风湿的功效，用于治疗功能性阳痿、前列腺炎、男性不育及风湿等症[1]。根据其用途、成分和制法，按2010年版《中国药典(一部)》微生物限度检查法[2]，应进行细菌数、霉菌及酵母菌数测定，并对控制菌－大肠埃希菌和沙门菌进行检查。现按规定建立微生物限度检查方法，并加以验证。

1 试验材料

复方玄驹片(施强药业集团有限公司，批号为20090101，20090102，20090103);营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、4－甲基伞形酮葡萄糠苷酸培养基(MUG)、四硫磺酸钠亮绿基础培养基(TTB)、胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)、曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)均购自北京三药科技开发公司;氯化钠蛋白胨缓冲液(pH=7.0，杭州微生物试剂有限公司)。大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus aureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida aibicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B)50094]均购自中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及沙门菌取于35℃培养24 h的营养肉汤培养物，白色念珠菌取于25℃培养48 h的改良马丁培养物，黑曲霉菌取于25℃培养7 d的改良马丁琼脂培养物，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5 mL，洗下孢子置无菌试管中。以上菌悬液用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释法，稀释至菌数约为50～100 cfu/mL，备用。

2.2 供试液制备

取供试品10 g，加入pH为7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 mL，用磁力搅拌器搅拌使药片溶解分散，作为1∶10的供试液。

2.3 回收率预试验

为确定细菌、霉菌和酵母菌菌落数的测定方法，按照2010年版《中国药典》规定的试验菌株分别用常规法(0.5 mL/皿)、培养基稀释法(0.2 mL/皿)对供试品进行预试验。

常规法:取2.2项下制备的供试液1 mL和2.1项下制备的菌液1 mL，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，依法培养，进行菌落计数。结果，试验组中大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌、白色念珠菌及黑曲霉菌回收率均大于70%，达到2010年版《中国药典》要求。金黄色葡萄球菌的回收率小于70%，采用培养基稀释法对细菌计数作进一步预试验。

培养基稀释法:取供试液1 mL等量注入2个平皿，每个平皿注入0.5 mL，同时每个平皿注入金黄色葡萄球菌菌液1 mL，立即倾注营养琼脂培养基，依法培养，进行菌落计数。结果金黄色葡萄球菌的回收率小于70%。采用每个平皿注入0.2 mL，用同种方法操作，结果金黄色葡萄球菌的回收率大于70%，加收率达到2010年版《中国药典》要求。结果见表1。可见，供试品对金黄色葡萄球菌有抑制作用，用培养基稀释法(0.2 mL/皿)可消除抑制作用，使回收率符合2010年版《中国药典》要求。

表1 供试品对金黄色葡萄球菌的抑制作用

2.4 细菌、霉菌和酵母菌检查方法验证

取3个批号的供试品，按回收率预试验结果，细菌计数采用培养基稀释法(0.2 mL/皿)，霉菌和酵母菌采用常规法，每个批号分为4个组，对供试品作细菌、霉菌和酵母菌检查方法验证。结果见表2。

表2 供试品菌落数及回收率试验结果(%)

2.5 控制菌检查方法验证[3]

试验组:对于大肠埃希菌，取1∶10供试液10 mL及10～100 cfu/mL大肠埃希菌菌液加入胆盐乳糖培养基100 mL中，依法培养，按相应的大肠埃希菌检查方法检查。对于沙门菌，取供试品10 g置200 mL的营养肉汤培养基中，加入10～100 cfu/mL乙型副伤寒沙门菌菌液，用磁力搅拌器搅拌，使药片溶解分散，依法培养。按相应的沙门菌检查方法检查。结果见表3。

阴性对照组:取相应稀释液替代供试液，不加试验菌，检查方法同试验组。

表3 控制菌(大肠埃希菌、沙门菌)检查结果

阳性对照组:取相应试验菌菌液1 mL，不加供试液，检查方法同试验组。

可见在控制菌检查中，试验组的细菌生长良好，检出试验菌，阳性对照组检出试验菌，阴性对照组无菌生长，故供试品的控制菌检查可采用常规法。

3 讨论

复方玄驹片为口服制剂，根据预试验结果，本品对金黄色葡萄球菌有抑制作用，文献[4]处方中蛇床子有抑制金黄色葡萄球菌的作用，这与试验结果基本一致。试验显示，采用培养基稀释法(0.2 mL/皿)可消除金黄色葡萄球菌的抑制作用，使回收率大于70%。经验证确定，细菌计数采用培养基稀释法(0.2 mL/皿)，霉菌、酵母菌计数和控制菌检查采用常规法，符合2010年版《中国药典》微生物限度检查方法的要求，可作为复方玄驹片的微生物限度检查方法。

[1]WS3－014－2003(Z)－2008，国家食品药品监督管理局国家药品标准[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录ⅩⅢC，79.

[3]中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社，2010:351.

[4]高学敏.中药学(供中医药专业用)[M].北京:中国中医药出版社，2002:597－598.