二氢生物喋呤还原酶参与调控HEK293T细胞自噬作用的初步研究

古艳婷，赵婷婷，李 平，张浩军，朱 斌，韩文兵，董 晞，费 敏，孙斯凡

（1.北京协和医学院，北京 100021；2.卫生部中日友好医院临床医学研究所，北京 100029）

糖尿病肾病的发病机制复杂，至今仍未完全阐明。许多研究认为糖尿病肾病时存在着自噬活性的下调，自噬途径受到抑制可导致细胞内受损的细胞器或蛋白大量积聚，足细胞完整性受到破坏、肾小管上皮细胞损伤及肾肥大等病理进程，参与了DN的发生发展［1］，而自噬激活对肾损伤有保护作用并可维持足细胞完整性。课题组在前期差异蛋白质组学中发现，二氢生物喋呤还原酶（dihydropteridine reductase，QDPR）在自发性II型糖尿病模型OLETF大鼠肾脏损害时的氨基酸发生突变，但该基因产物是否参与糖尿病肾病的发生发展还未有报道。本研究构建了野生型和突变型的QDPR重组质粒初步探讨了二氢生物喋呤还原酶对自噬作用的影响，以期为深入研究其在糖尿病肾病发病机制中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK 293T细胞、绿色荧光蛋白（GFP）为中日友好医院临床医学研究所药物药理室保存；真核表达载体pcDNA3.1/V5-His（美国Invitrogen公司）；新型pUM-T快速克隆试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）、大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；高保真PCR扩增试剂盒（德国Roche公司），T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoR V、Pst I、Xba I（美国NewEngland Biolabs公司）；限制性内切酶Xba I、逆转录试剂盒（加拿大Fermentas公司）；凝胶回收纯化试剂盒、质粒中提试剂盒（德国QIAGEN公司）；DNA Maker DM5000（北京康为世纪生物技术有限公司）；鼠单抗V5抗体（美国Invitrogen公司）；兔多抗LC3（美国Sigma公司），兔多抗Beclin1抗体（美国Sigma-Aldrich公司），山羊抗小鼠IgG抗体（美国Abcam公司）；羊抗兔IgG抗体（美国Abcam公司）；Western Lightening ECL（美国Perkin Elmer公司）；胎牛血清（美国GIBCO公司）；高糖DMEM培养基干粉（美国GICBO-BRL公司）。

1.2 野生型和突变型QDPR重组质粒的构建

1.2.1 引物设计与RT-PCR扩增 根据 G eneBank中大鼠QDPR mRNA序列设计引物，上游引物引入EcoR V酶切位点，下游引物引入 X ba I酶切位点，由北京擎科生物技术有限公司合成。引物序列如下：上游5＇-AGATATCTGGCGGCTTCGGGCGAGGC-3＇；下游5＇-ATCTAGAGAAATAGGCTGGAGTAAGCT-3＇，分别以正常LETO大鼠与OLETF糖尿病大鼠肾脏皮质cDNA为模板，采用高保真PCR试剂盒扩增正常QDPR以及突变QDPR cDNA片段，PCR反应体系（50μL）中上、下游引物各1μL，cDNA 2μL。反应条件为：94℃预变性2 m in；94℃变性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸1 m in；共循环32次后72℃延伸10 m in。对PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分离，之后进行回收纯化，-20℃保存。

1.2.2 pUM-T克隆 PCR产物回收纯化后克隆至pUM-T载体，转化到 D H5α感受态细胞，挑选阳性单克隆进行酶切鉴定及测序。

1.2.3 重组质粒的构建 用EcoR V、Xba I双酶切QDPR/pUM-T获得QDPR目的片段；用EcoR V、Xba I双酶切 p cDNA3.1/V5-His作为载体。用 T 4DNA连接酶连接目的片段与载体，构建野生型 r QDPR/ pcDNA3.1/V5-His重组质粒（rQDPRwt）和突变型rQDPR/pcDNA3.1/V5-His重组质粒（rQDPRmut）。

1.3 HEK293T细胞转染及分组

HEK 293T细胞常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，于转染前24 h传代，以2x106/孔的细胞密度接种于 1 0 cm培养皿中，在37℃、5％CO2条件下培养24 h，细胞贴壁后利用磷酸钙共沉淀法转染，共转染3次。实验分组：野生型重组质粒组（rQDPRw t组），突变型重组质粒组（rQDPRmut组），pcDNA3.1/V5-His载 体组（control vector组）。绿色荧光蛋白（GFP）作为转染效率的参照物，转染72 h后倒置荧光显微镜下观察转染效率。

1.4 RT-PCR检测LC3，Beclin1转录水平表达

转染72 h后收集细胞，Trizol法提取细胞总RNA。取2μg RNA进行反转录，按Fermentas cDNA反转录试盒的步骤进行。PCR采用立陶宛MBl公司试剂盒PCR反应扩增，以CyclophilinB作为内参照。各引物序列见表1。PCR反应体系（12.5μL）中上、下游引物各0.5μL，cDNA 2μL。反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s；退火30 s（LC3为52℃，Beclin1为56℃）；72℃延伸45 s；共循环35次后72℃延伸10 min。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统观察条带，以目的条带吸光度值与CyclophilinB吸光度值比值作为目的产物的半定量值，Image J软件进行分析。

表1 PCR引物序列及产物长度Tab.1 The primer sequences and the length of products

1.5 WesternBlot检测测LC3I，II，Beclin1蛋白水平表达

转染72 h后收集细胞，吸弃培养液，PBS轻洗，加入预冷的细胞裂解液，冰浴10 min后移至离心管，超声离心，分光光度计进行蛋白定量。分别取60μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜，5 g/L脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜，用鼠单抗V5抗体（1∶5000），LC3抗体（1：2000），Beclin1抗体（1∶2000）及抗β-actin抗体（1∶2000），4℃过夜。山羊抗鼠IgG（1∶10000），山羊抗兔IgG （1∶3000）孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL化学发光显色后显影。ImageJ软件进行分析吸光度（A）值，并计算LC3I，II和Beclin1的A值与β-actin A值的比值，分析各组LC3 I，II和Beclin1蛋白的相对表达水平。

1.6 统计学方法 数据资料用（±SD）

表示，采用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理。组间差异采用One-way ANOVA，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒鉴定结果

重组质粒构建后经酶切鉴定，结果显示酶切条带与预期一致，野生型重组质粒测序结果与GeneBank BLAST比较后证实为QDPR cDNA序列，突变型重组质粒测序结果也显示突变位置正确，说明野生型和突变型重组质粒构建成功（数据未显示）。

2.2 WesternBlot检测融合蛋白水平表达

转染72 h后收集细胞蛋白，用鼠单抗V5抗体检测到rQDPRwt组和rQDPRmut组融合蛋白的表达，对照组未见目的蛋白表达，见图1。结果表明野生型和突变型重组质粒能够在HEK 293T细胞中正确表达。

2.3 QDPR高表达以及QDPR突变高表达后对LC3，Beclin1mRNA水平的影响

图1 Western blot检测转染后融合蛋白表达Fig.1 The detection of fusion protein after transfection

野生型QDPR重组质粒和突变型QDPR重组质粒转染细胞72 h后，RT-PCR检测结果显示，与对照组相比，rQDPRwt组LC3 mRNA表达水平显著上调（P＜0.05），Beclin1表达水平无统计学意义，rQDPRmut组与对照组相比LC3和Beclin1表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。（图2，3）。

2.4 QDPR高表达以及QDPR突变高表达后对LC3，Beclin1蛋白水平的影响

图2 QDPR对LC3和Beclin1 mRNA表达的影响Fig.2 The effect of QDPR on the mRNAlevel of LC3 and Beclin1

图3 QDPR对LC3和Beclin1 mRNA表达影响的半定量分析（*P＜0.05 vs.control）Fig.3 The semiquantitative analysis of QDPR on the mRNA level of LC3 and Beclin1（*P＜0.05 vs.control）

野生型QDPR重组质粒和突变型QDPR重组质粒转染细胞72 h后，Western blot检测结果显示，与对照组相比，rQDPRwt组LC3和Beclin1蛋白表达量显著上调（P＜0.05），rQDPRmut组LC3和Beclin1表达差异无统计学意义（P＞0.05）。（图4，5）。

图4 QDPR对LC3和Beclin1蛋白表达的影响Fig.4 The effect of QDPR on proteinlevel of LC3 and Beclin1

3 讨论

二氢生物喋呤还原酶蛋白以二聚体形式在动物体内广泛分布［2］，该酶在四氢生物喋呤（tetrahydrobiopterin，BH4）再生过程中起到重要作用，其主要功能是催化醌型二氢生物喋呤（quinonoid dihydrobiopterin，qBH2）还原成BH4，对维持体内BH4含量稳定有着重要意义［3］。BH4生理功能广泛，而这些生理功能和DN的发生关系密切。BH4是3种一氧化氮合酶（nitric oxide syhthase，NOS）激活所必需的辅助因子，而NOS是体内NO产量的主要来源［4］。有研究表明NO和自噬有密切关系［5］。课题组在前期差异蛋白质组学研究中发现，与正常LETO大鼠相比，自发性II型糖尿病模型OLETF大鼠QDPR基因发生突变，但该基因是否参与糖尿病及其并发症的发生发展有待进一步研究。

图5 QDPR对LC3和Beclin1蛋白表达影响的半定量分析（*P＜0.05 vs.control，＊＊P＜0.01 vs.control）Fig.5 The semiquantitative analysis of QDPR on proteinlevel of LC3 and Beclin1（*P＜0.05 vs.control，＊＊P＜0.01 vs.control）

自噬是细胞通过溶酶体对自身结构的吞噬降解过程，主要是清除、降解细胞内受损伤的细胞结构、不需要的生物大分子以及衰老的细胞器等，同时也为细胞器的构建提供原料［6］。然而，过度的自噬也会引起细胞的损伤或死亡。因此，自噬对细胞的作用具有两面性［7］。近年来有研究显示在STZ诱导的1型DN大鼠肾组织自噬标志分子LC3-2明显降低，糖尿病肾病存在着自噬活性的下调，而自噬激活在肾损伤中可能发挥着细胞保护作用［8］。自噬作用可通过Western blotting检测自噬蛋白LC3和的Beclin-1表达量等方法来反映。LC3前体（proLC3）在蛋白水解酶的作用下剪切C末端形成LC3I，最后经泛素样加工修饰过程成为与磷脂酰乙醇胺（PE）结合的LC3II，能靶向定位于自噬体膜，参与自噬的形成［9］。目前认为LC3II是自噬体的标志分子，是代表自噬作用的主要指标。Beclin-l基因是哺乳动物最早发现的一个自噬基因，其表达强度与自噬活性密切相关［10］。本研究通过构建QDPR野生型和突变型重组质粒，观察了QDPR对HEK293T细胞自噬作用的影响，结果显示野生型QDPR重组质粒组LC3II水平和Beclin-l水平显著高于对照组和突变组，提示QDPR可能诱导自噬活性或者使发生自噬的潜能增加，当其93位氨基酸突变后对自噬的这一调控作用下降。由此我们推测QDPR可能和糖尿病肾病的发生发展有关，并且课题组发现的QDPR突变位点可能是其调控自噬作用的关键位点。但是它是如何调控自噬并参与疾病的具体分子机制还不清楚，有可能是通过影响NO的生成和氧化应激的一些变化或某些信号转导机制来完成，但在疾病中究竟发挥了何种作用，目前仍在探索，也是我们下一步研究的方向。

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