硫氧还蛋白在凋亡途径中的作用机制

徐 涛，于 涛

（东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心/东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨150040）

硫氧还蛋白（Trx）是一种小分子蛋白质，它广泛存在于原核和真核生物中。1964年，Trx在大肠杆菌中首次被定义为氧化还原蛋白［1］。随后，1967年，Moore EC［2］在大鼠的肝癌细胞中发现了硫氧还蛋白，1977年，Pigiets.P［3］在大肠杆菌中提取纯化得到硫氧还蛋白，并发现它参与到一系列的氧化还原途径中。1995年，Gasdaska.PY［4］成功克隆出胞浆中的Trx1和线粒体中的Trx2。至此，一系列有关Trx的研究相继展开。近些年，人体内癌细胞中Trx的含量，以及Trx1和Trx2在体内参与的代谢途径成为研究的热点。

1 Trx的结构特点

Trx的分子量约是12×103，是由4个β折叠和3个α螺旋组成的球状蛋白。4个β折叠构成一个疏水核心，核心的终末端被3个α螺旋包绕。这种折叠结构普遍存在于氧化还原蛋白家族中。Trx参与氧化还原反应的重要活性位点是Cys-Gly-Pro-Cys，它相对来说比较保守，可以与二硫键相互作用，还原被氧化的多种蛋白，而其自身从还原态（SH2 -）变成氧化态（S-），又可以通过TrxR的作用，恢复到还原态［5］。

目前Trx主要分为Trx1和Trx2两种类型，Trx1位于细胞浆和细胞核中，包含105个氨基酸，而Trx2仅位于线粒体中，不同于Trx1，Trx2由166个氨基酸构成，除了保守的还原结构外，还包含了60个氨基酸组成的N末端延伸（图1），这段引导序列对于Trx2存在于线粒体内部起关键作用［6］。Trx1和Trx2由于存在的位置不同，所以他们介导的氧化还原途径也有所不同。

图1 Trx1和Trx2氨基酸序列示意图Fig.1 The amino acid sequence of Trx1 and Trx2

2 Trx在凋亡途径中的功能

2.1细胞凋亡

细胞凋亡是一种程序性坏死过程，它是体内进行正常新陈代谢时所必须的，正常情况下，体内会根据机体自身的情况以及对外界的应激情况做出相应的调整，包括细胞的迁徙，增殖，分化和凋亡［7］。细胞凋亡整体分为两大途径，一是受体配体结合的外源途径，一是线粒体参与的内源途径。外源途径是通过死亡配体与相应受体（主要是肿瘤坏死因子：tumor necrosis factor：TNF）结合，活化半胱天冬酶家族成员，致使细胞凋亡。内源途径则是通过线粒体为中心引发的凋亡途径。当外源途径中的半胱氨酸天冬酶8（caspase8）活化后，会切割促凋亡因子Bid，促使促凋亡因子Bax从胞浆中转移到线粒体的膜上，改变线粒体膜的通透性，释放细胞色素C（cytc），最终导致细胞的凋亡［8-9］。

引发凋亡途径的起始因子有很多，而其中最为重要的是TNF家族成员TNF-а和活性氧簇（reactive oxygen species：ROS），TNF-а也是引发ROS产生的重要途径之一［10］，所以两条途径并不是独立存在而是相互联系相互调节的，内源途径对外源途径起到级联放大的作用［9.11］，两条途径中涉及的许多凋亡因子都与Trx有一定的相关性，研究他们之间的关系对于进一步了解细胞凋亡有着重要的意义（图3）。

2.2 Trx在凋亡途径中的作用

2.2.1 Trx的抗氧化作用

在细胞凋亡的过程中，会产生引发凋亡的关键因子ROS，它会诱发凋亡途径，致使细胞凋亡。这时体内的还原系统Trx会直接清理ROS，起到抗氧化的作用［12］。

作为体内的还原系统，Trx具有对抗自由氧基的功能，主要源于以下两个因素，第一：它包含保守序列-Cys-Gly-Pro-Cys-，可以与巯基作用，还原已氧化蛋白的巯基基团，自身形成二硫键，恢复蛋白的生理功能，维持细胞的生理活性，这段保守的氨基酸序列是Trx还原氧化物的关键活性位点。32位的半胱氨酸（C32）和35位的半胱氨酸（C35）对于Trx1的还原起重要作用，当受到氧化作用时，C32和C35内部会形成二硫键，这时Trx会暂时失去还原功能，再由硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase：TrxR）还原成本身的状态［13］，参与体内可逆的氧化还原反应（图2）。人体正常代谢会导致许多自由氧基的产生，一般情况下，体内通过还原系统进行清理，但如果电子传递的过程中出现电子链的断裂，产生大量的ROS，体内的还原系统不足以清除，就会导致细胞凋亡。清理ROS的功能，体现了Trx的抗氧化作用，而这种抗氧化作用也间接的抑制了由ROS介导的细胞凋亡。第二，Trx对于各种还原酶系统都有显著的调节作用，例如超氧化物歧化酶（super oxidase dimutase：SOD），SOD对于治疗因超氧离子引起的各种疾病均有一定的疗效，Trx1可以上调SOD的mRNA，间接地活化SOD［10，14］（图3），从而抵抗体内的氧化反应。又如谷胱甘肽还原系统，Trx是人体内谷胱甘肽过氧化物酶的电子供体，所以它的上调和下调都对谷胱甘肽系统有很大的调节作用［15-16］。所以Trx除了自身具有还原的作用外，对于其他的还原酶系统也起到了一定的上调作用，通过各种酶的相互协作，共同抵抗体内的氧化反应。

在Trx系统中，由于Trx2存在于线粒体内部，而线粒体是进行氧化呼吸的重要场所也是引发内源途径的发生场所，所以Trx2的抗氧化作用就显的尤其的突出，从而对线粒体引发的凋亡有重要的调节作用［17］。在整个氧化磷酸化的过程中，会有0.4％-4％的氧被释放到线粒体中，也就是ROS［10］。线粒体中包含三大复合体，Ⅰ和Ⅲ对于ROS的产生是必要的，但机制并不清楚，而Trx2对于呼吸链的复合体Ⅰ有抑制的作用，可以提高线粒体的膜电位，使活性氧逆转线粒体膜电位产生困难，从而抑制细胞的凋亡［18］。事实上，ROS的产生途径有很多，生理条件下的呼吸链以及病理条件下都会产生ROS。在病理条件下产生的ROS会导致细胞的过度凋亡，致使疾病的发生，所以Trx表现出来的抗氧化作用对于维持体内正常的生理条件是至关重要的。

图2 Trx氧化还原过程Fig.2 The redox processes of Trx

2.2.2 Trx调节凋亡转录因子的作用

Trx除了可以起到抗氧化的作用外，还可以调节一些凋亡转录因子，例如转录因子NF-κB（nuclear factor-k-gene binding）和AP-1（activator protein-1）等［19］。

Trx对于NF-κB有一定的调节作用（图3），NF-κB属于Rel家族的转录因子，参与调节与机体免疫、炎症反应、细胞分化有关的基因转录，进一步对凋亡和肿瘤的发生进行调节。在有氧化剂存在的情况下，NF-κB与DNA的连接会受到抑制，还原型的Trx可以抑制氧化剂，提高DNA和NF-κB的连接，活化NF-κB，并且这种还原作用比L-Cys和还原型的谷胱甘肽的作用更为强烈［17，20］。同时Trx可以通过c-Jun氨基末端激酶（Jun N-term inal Kinase：JNK）途径调节NF-κB。但若过量的表达Trx2也会有效地抑制NF-κB的活性［11］。NF-κB的活化在炎症诱发的肿瘤形成中发挥重要作用，同时发现NF-κB除了可以促进细胞存活外也可发挥促凋亡的作用，抑制肿瘤发生发展。由于NF-κB在肿瘤形成中存在两方面的作用，因此了解Trx对NF-κB两方面的调节机制，可以为肿瘤临床治疗提供理论依据［21-23］。

Trx还可以调节Ap-1，AP-1会对各种刺激如应激、辐射或生长信号等作出生理或病理应答，同时参与细胞的增殖、分化和转化等过程，在肿瘤的形成、转移和侵袭中发挥重要作用，研究发现AP-1与肿瘤的转化及转移密切相关，Trx可以通过JNK途径调节Ap-1，提高AP-1的表达，从而促进细胞的存活［24］。

2.2.3 Trx的抗凋亡作用

Trx对细胞的存活有重要的作用，若在细胞内转染Trx1SiRNA或Trx2SiRNA，都会造成细胞的凋亡。在凋亡过程中，凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal-regulating kinase：ASK1）参与了细胞的凋亡过程［12］。

ASK1是凋亡途径中的重要的蛋白，C末端为调节性结构域，此结构域可以与调节TNF受体家族的成员因子（TNF receptor associated factor：TRAF）结合［25］，当TNF与其受体结合之后，会募集接头蛋白（TRAF2），TRFA2会连接ASK1和MEKK1［7］，使信号得到传递，TRAF对于ASK1结合活化促分裂素原活化蛋白激酶（m itogen-activated protein kinase：MAPKs）起重要作用。ASK1的N末端为功能性结构域，有648个氨基酸组成，N末端对于MAPKs起到活化作用，MAPKs是ASK1可活化多种下游信号中最为重要的一个，许多内源性的刺激，包括生长因子、细胞因子和应激反应都会活化MAPKs的三级联反应，即MAP3K-MAP2K-MAPK，MAPKs家族的成员共有3个，其中应激激活的蛋白激酶p38 （p38MAPKs），c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-term inal kinase：JNK），胞外信号调节激酶（extracellular signal-reg-ulated kinase：ERK）是细胞凋亡的重要信号途径，参与不同的应激反应。在ASK1缺失的细胞中，可以抵抗TNF和ROS诱导的细胞凋亡［26］，说明ASK1在细胞凋亡途径起着中间枢纽的作用。ASK1可以通过丝裂原活化蛋白激酶MKK4/丝裂原活化蛋白激酶MKK7活化p38MAPKs，也可以通过丝裂原活化蛋白激酶MKK3/丝裂原活化蛋白激酶MKK6途径活化p38［27］。体内存在许多的抑制因子可以抑制ASK1介导的细胞凋亡，在哺乳动物中，Trx则是ASK1的直接抑制剂［28］，而Trx/ASK1-MAPKs也成为引发细胞凋亡的经典途径［29］。

Trx一般会与ASK1的N末端相连，在体内抑制ASK1的活性，同时也就抑制了ASK1下游的MAPKs家族的活性，但当机体内产生某种氧化剂的时候，例如：TNF-а，氧化应激导致的ROS的产生等，就会阻断Trx-ASK1复合体的连接，氧化Trx（使C32和C35之间形成分子内的二硫键），释放ASK1（图2），在TRAF2的作用下活化下游的MAPKs家族成员，启动凋亡程序，调节MAPKs的TRAF2必须在Trx和ASK1分离之后，才会与ASK1结合［30］，启动下游MAPKs的级联反应，所以Trx对于ASK1引发的凋亡途径起到了重要的调节作用。

Trx，由于存在的位置不同，导致抑制凋亡的途径也不同。Trx1主要抑制外源途径的凋亡，Trx2则阻止内源途径的凋亡。已经证实ASK1即存在于胞浆中，又存在于线粒体中，Trx1和Trx2分别抑制胞浆和线粒体内的ASK1，以阻断不同途径的细胞凋亡。但胞浆和线粒体中的ASK1启动的凋亡途径并不相同，在TNF诱导的细胞凋亡中，若在细胞中加入JNK的抑制剂，则可以完全的抑制TNF诱导的JNK途径以及Bid的切割和Bax的转位，但在存在JNK抑制剂的线粒体中发现ASK1大量的活化，而且cytc的释放也没有完全被阻断，说明胞浆中的ASK1介导的细胞凋亡包含了JNK途径，但在线粒体中ASK1并没有通过JNK途径致使细胞凋亡［31］，但也有一些学者认为JNK对于cytc的释放必不可少，他们认为JNK可以使Bcl-2磷酸化，改变线粒体的膜电位同时改变线粒体膜的通透性，释放cytc，启动cytc介导的凋亡途径，JNK对于线粒体诱发的细胞凋亡起到信号转导的作用［7，32］。综合以上两种说法可以推测TNF促使了Trx1/ASK1的分离，导致ASK1活化了JNK途径，进而JNK在外源途径切割Bid，活化Bax，以促进内源途径的凋亡。而内源途径中ROS引发的Trx2/ASK1引起的凋亡也是细胞损伤的重要途径［33］，虽然这条途径并没有完全被了解清楚，但是可以确定Trx2对于ROS起到清理作用，同时抑制线粒体中的ASK1，对线粒体介导的凋亡途径起到一定的抑制作用。Trx1和Trx2都是通过锚定凋亡信号分子，从而抑制细胞的凋亡（图3）。

由于线粒体膜的通透性与Bcl-2家族的成员有密切的关系，所以在研究细胞凋亡时，Bcl-2家族成员也常常成为研究焦点。在研究肺缺血再灌注损伤时，发现Trx干预组的Bax和ASK1表达显著下降，说明Trx可以对Bax起到抑制的作用，阻止了Bax对于线粒体膜通透性的改变，抑制细胞的凋亡［34］。

图3 Trx与凋亡相关因子之间的关系Fig.3 Trx relate to apoptotic factors

3 Trx与疾病

许多疾病的产生都是由于凋亡途径受损而引起的，而Trx广泛表达在各种细胞中，在凋亡途径中也起到了上游调控调因子的作用，因此在与凋亡引起的相关疾病中起着重要的调控作用。而由于Trx具有生长因子，抗凋亡，抗氧化的作用，因此许多肿瘤细胞中Trx的含量都会高于正常细胞，其中包括肺癌细胞，结肠癌细胞，胰腺癌细胞，乳腺癌细胞，胃癌细胞等。所以利用Trx在凋亡途径中的重要作用来治疗疾病也成了现在的研究热点。

Trx参与到许多的肺部疾病中，Trx-ASK1-JNK在吸烟引起的细胞凋亡中经常见到，Lee YC［31］等人发现吸烟会导致大量的ROS产生，而Trx的高表达可以抑制JNK的表达从而减少细胞的凋亡；同时Sato A［36］等人发现提高Trx1可以改善吸烟引起的肺部炎症；在临床实验中，发现如果提高Trx的表达可以保护肺部组织免受损伤，暗示着未来Trx可能作为关键因素来治疗肺部疾病［37］。

某些病毒的作用机制包含了Trx-ASK1-MAPKs这条途径，Yang TC发现日本脑炎病毒又称为乙型脑炎病毒进入体内，引起氧化应激的发生，Trx的含量下降，ASK1-MAPKs途径启动，导致细胞凋亡引发神经性的疾病［38］。

同样，许多药物的作用机制也包含Trx-ASK1-MAPKs途径，Lim PLK在研究曲格列酮的副作用时，发现曲格列酮破坏了电子传递链，导致线粒体内产生ROS，Trx2被氧化，从而引发ASK1-JNK途径，最终引起肝损伤［33］。YH Ma［39］等人发现，人重组的Trx1对脑缺血有治疗作用，由于脑缺血会导致ONOO-引起的氧化应激和细胞凋亡，而人重组的Trx1可稀释ONOO-并抵抗氧化/氮化引起的细胞凋亡。

4 展望

由于Trx在许多肿瘤细胞中的含量都比正常的细胞高，而且在凋亡途径中又起着至关重要的作用，所以透彻的了解Trx在凋亡途径中的作用机制，可对预防和治疗疾病开辟一条新的道路，相信Trx将成为肿瘤治疗中有前景的又一靶点分子。

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