透明质酸结合蛋白和CD44s与乳腺浸润性微小乳头状癌高淋巴结转移的关系

李玉桑，冷昌龙，刘跃辉

(1中南民族大学药学院病理学研究室，武汉430074;2广东省佛山市高明区人民医院，佛山528500)

浸润性微小乳头状癌(IMPC)属于乳腺导管癌 形态学范畴的新类型，是一种罕见而具有高度淋巴转移的病理组织结构.有研究表明，IMPC大多数与其他类型导管癌混杂，单纯性IMPC病例少见，但占有部分比例IMPC病例同样具有侵袭性、转移率均高的生物学行为［1-4］.在诸多影响癌浸润及转移的相关因素研究中，均发现普遍存在于细胞外基质中的透明质酸(HA)与癌细胞表面受体有着一定的相互关系.Takeda等研究发现，肺腺癌组织中存在大量透明质酸［5］，并且透明质酸还能诱导肿瘤细胞黏附和迁移［5，6］.透明质酸结合蛋白(HABP)是细胞外基质中的一种蛋白多糖，可与 HA特异性结合.CD44s是一种细胞表面跨膜糖蛋白，存在于多种细胞上，并属于粘附分子中的透明质酸受体，在许多肿瘤中均有异常表达［7］.有报道指出CD44s蛋白参与细胞-细胞，细胞-细胞外基质之间的特殊粘附，与肿瘤的浸润和转移相关［7-9］.Turley等发现 CD44s与HA结合后可以促使多种细胞伸出伪足，细胞运动能力增强［10］.因此，本实验采用免疫组织SP法和组织染色法，我们将探讨透明质酸结合蛋白(HABP)与CD44s在IMPC组织中的表达特征及相互关系，研究其与IMPC淋巴结转移的相关性.

1 材料与仪器

1.1 材料

依据如图1所示组织结构特征，镜检了日本广岛大学附属医院1990～2008年间乳腺癌手术切除病理切片标本(金子真弓副教授真诚提供)，并获取疑似浸润性微小乳头状癌的34例，然后将其石蜡标本制成4μm厚切片进行免疫组化染色.患者全为女性，年龄最大75岁，最小38岁，平均53.5岁.

1.2 实验仪器

切片机(德国，Leiea Rm2265);超精细电动显微镜系统(日本，NikonEclipse Ti).

2 实验方法

2.1 免疫组化方法

采用Super Vision两步法，切片常规脱蜡至水后用3%双氧水阻断内源性过氧化物酶10 min，水洗后再置于枸椽酸缓冲液中微波抗原修复10 min，室温自然冷却.余步骤按试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木素复染，树胶封片.所用一抗CD44鼠抗人单克隆抗体，CD44抗体稀释度为1∶100，购自NOVO CASTRA公司.免疫组化试剂盒均购自NICHIREI HISTOFINE公司.实验设阳性对照和阴性对照(PBS代替一抗).

2.2 组织染色法

切片常规脱蜡至水后用avidin和biotin封闭液在室温下分别孵育20min，再置于0.3%双氧水阻断内源性过氧化物酶30min，1%BSA溶液孵育1 h，加biotin标识透明质酸结合蛋白(HABP，试剂盒购自日本生化工业株式会社)2 h，HRP标识strept-abitin 15 min，以上各步骤均在室温下进行和各步骤间用PBS缓冲液各洗3次后，进行DAB显色.

2.3 阳性指标判定

阳性反应肿瘤细胞膜出现棕黄色颗粒，阳性细胞数大于10%判定为阳性.

2.4 统计学分析

两组数据间的比较采用INSTAT3软件中Fisher's exact test进行统计学处理，P＜0.05表示有显著差异.

3 结果

3.1 疑似浸润性微小乳头状癌的组织形态学鉴别诊断

疑似IMPC病例的HE切片镜检(如图1)，发现该组织中具有明显腔隙、丛状生长的腺上皮癌细胞形成桑椹样的微乳头状及不规则巢团状、小腺管样结构，腔隙间具有类似脉管束构造而缺乏内皮细胞.癌巢间质成分甚少，癌巢周围的间质组织中可见明显的淋巴管内癌细胞侵袭.据此组织形态特征将34例疑似IMPC进一步分为21例IMPC及13例Pseudo-IMPC(鉴别法参照文献［1］).

图1 IMPC组织学特征:在明确腔隙内、丛状生长的腺上皮癌细胞形成桑椹样排列的微乳头状癌，主瘤间质成分甚少.在主瘤周围间质组织中可见明显的淋巴管内癌细胞侵袭(红色箭头所示，彩图见封三，HEX200)Fig.1 Distinctive histological features of IMPC

3.2 IMPC及IDC组织中HABP的表达

在对21例IMPC组织中透明质酸结合蛋白(HABP)的表达变化进行检测时，发现其在15例癌细胞巢的外周膜及间质均表达强阳性(如图2)，在其它5例癌细胞未表达.其在13例Pseudo-IMPC中3例呈癌细胞以及间质细胞均表达阳性，其中10例癌细胞未表达，而间质细胞表达弱阳性.两组之间的表达差异具有显著性的统计学意义(P=0.0042).此外，IMPC与Pseudo-IMPC之间淋巴结转移阳性率相比较具有显著性统计学意义(P=0.0078，表1所示).

图2 IMPC及Pseudo-IMPC组织中透明质酸结合蛋白的表达.(A)HABP在IMPC组织中癌细胞块的细胞膜周围以及间质中呈现阳性;(B)HABP在Pseudo-IMPC组织中癌细胞内表达呈现阴性，而在间质细胞呈现阳性.DAB显色，X200，彩图见封三Fig.2 Expression features of HABP in IMPC and Pseudo-IMPC

3.3 IMPC及Pseudo-IMPC组织中CD44s的表达

对21例IMPC组织中CD44s的表达进行检测时，发现15例IMPC癌细胞巢癌细胞连接面表达强阳性，而在癌细胞与间质相接的外侧面不表达(如图3)，其中6例癌细胞未表达.而CD44s在13例Pseudo-IMPC中8例癌细胞膜全周性呈现阳性表达，其中5例癌细胞未表达，两组之间的表达差异没有显著性的统计学意义(表1所示).

图3 IMPC及Pseudo-IMPC组织中CD44s的表达.(A)CD44s在IMPC组织中癌细胞间内侧膜呈现阳性表达(不完全性表达);(B)在Pseudo-IMPC组织中癌细胞膜全周性呈现阳性表达.DAB显色，X200，彩图见封三Fig.3 Expression features of CD44s in IMPC and Pseudo-IMPC

表1 IMPC与Pseudo-IMPC病例组织间CD44s、HABP的表达及淋巴结转移关系Tab.1 Expressions of CD44s and HABP related to high rate of lymph-nodemetastasis in IMPC and Pseudo-IMPC

采用Fisher's exact test检测IMPC与Pseudo-IMPC两组中相应数据间的差异.

4 讨论

IMPC是一种罕见乳腺导管癌而具有高度淋巴转移的生物学行为.有关IMPC的高侵袭性、高转移率的病理机制尚不十分清楚.但在诸多影响癌浸润及转移的相关因素研究中，均发现细胞外基质中的透明质酸与癌细胞表面受体关系密切.透明质酸是细胞外基质的重要成份，它可与透明质酸结合蛋白(HABP)有特异结合的特性，对于维持组织结构、细胞黏附、活化、迁移以及细胞信号的转导有重要作用，与癌细胞表面受体有着一定的相互关系［11］.由此可见，HABP与乳腺癌有一定联系，可能参与了其侵袭和转移过程.本研究证实了HABP在IMPC组织中癌细胞及间质细胞中均呈强阳性表达.结合临床IMPC病例淋巴结转移率高的统计结果，可见，HABP与IMPC有着一定的联系，可能参与了其侵袭和转移的过程.

CD44s作为一种细胞表面跨膜糖蛋白，主要参与细胞间、细胞与基质间的特异性黏附过程.其在肿瘤组织中过表达，为肿瘤细胞的增殖、分化、转移和侵袭提供微环境［12］.CD44s也可通过促进肿瘤细胞与血管内皮细胞和细胞外基质的黏附，促进肿瘤细胞向基质侵袭，从而影响肿瘤细胞的迁移和运动能力［13，14］.本研究发现 CD44s在 IMPC 组织中癌细胞巢团内癌细胞连接面表达强阳性，而在癌细胞与间质相接的外侧面表达缺失，提示IMPC癌细胞团内细胞间结合力强，而癌细胞团与间质细胞缺乏结合粘附力.癌细胞巢团内细胞之间结合紧密表明其具有更强的运动能力和侵袭能力.而在IMPC的癌巢周围间质富含大量淋巴管生成［15，16］，丰富的淋巴管不仅为肿瘤细胞提供了转移通路，还能分泌多种营养或趋化肿瘤细胞的因子，促进肿瘤细胞存活与转移.Bourguignon等发现透明质酸与CD44s结合不仅影响细胞间粘附，而且刺激各种肿瘤细胞特异性功能促进乳腺癌的发展［17］.透明质酸也可使CD44s在癌细胞表面脱落.结合CD44s在IMPC中的表达特征以及IMPC的高淋巴结转移率，CD44s的脱落极有可能促进IMPC癌细胞巢团与间质的脱离，使癌细胞远离原发灶，进入淋巴道而造成侵袭、转移.

综上所述，CD44s在IMPC细胞中的不完全性表达和透明质酸结合蛋白的高表达，为 IMPC的淋巴道侵袭、转移潜能力提供了有利的微环境，是乳腺IMPC高淋巴转移的潜在高危因子.

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