L-谷氨酸-5-甲酯金属铜化合物的合成、表征及生物活性

金龙飞，范 昕，金呈之，王彦荣，吴勇飞，吴腊梅

(中南民族大学化学与材料科学学院，武汉430074)

L-谷氨酸类的金属配合物因其配位后具有复杂的共轭结构，与生物环境相似，目前对其金属配合物的研究已经成为热点［1-3］.文献［4］合成出金属钼与L-谷氨酸盐金属配合物，并对其晶体结构进行了研究.但关于L-谷氨酸-5-甲酯的金属配合物与生物活性的研究尚少.笔者在本室L-谷氨酸-5-甲酯金属镁和钙配合物研究的基础上［5］，成功合成出L-谷氨酸-5-甲酯金属铜配合物，并对其晶体结构、三磷酸腺苷分解的生物活性和抗菌活性进行了系统的测定和分析，为进一步深入研究L-谷氨酸-5-甲酯与不同金属进行配位后配合物的生物活性提供一定的参考.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

元素分析仪(Per kin Elmer 2400 CHN型，德国);高分辨傅立叶红外光谱仪(FT-IR NEXUS智能型，KBr压片，美国Nicolet公司);可见紫外分光光度计(UV-265型，日平岛津);数字熔点仪(X-4型，25℃，190～700 nm，北京泰克仪器有限公司);CCD X-射线单晶衔射仪(Bruker SMART APEX型，德国).

L-谷氨酸为生物试剂;无水甲醇、硫酸、三乙胺、乙酸铜，均为分析纯，使用前未进一步提纯.

1.2 实验方法

1.2.1 L-谷氨酸-5-甲酯的合成

L-谷氨酸-5-甲酯参照文献［6］合成.取 L-谷氨酸7.50 g(0.05 mol)置于烧瓶中，加入无水甲醇120 mL，边搅拌边加入98%浓 H2SO43.70 mL，25℃下反应4～5 h.用三乙胺的甲醇溶液(V(醇)∶V(胺)=2∶1)调节至pH=8.0，置冰箱中过夜.次日抽滤出固体，用95%甲醇进行重结晶，用无水甲醇洗涤.常温下真空干燥至恒重，纯品为白色晶状固体.产率93.8%.Tm.p.=169～170℃.元素分析，测试:C，45.02;H，6.89;N，8.71%. 计算(C6H11NO4):C，44.72;H，6.88;N，8.69%.FT-IR(KBr pellet，υ/cm-1):3130 ～ 2598 m，1730 s，1611 s，1583 s，1355 m，1080 m.

1.2.2 L-谷氨酸-5-甲酯合铜(Cu(C6H10NO4)2)的合成

将0.32 g(2.00 mmol)L-谷氨酸-5-甲酯溶于15 mL水中，在室温下搅拌使其完全溶解，缓慢滴加溶有0.21 g(1.05 mmol)Cu(CH3COO)2·H2O的5 mL水溶液，溶液中出现蓝色沉淀.继续反应30 min，过滤蓝色沉淀物，用蒸馏水洗涤，真空干燥至恒重.纯品为蓝色晶状固体.在合成过程中，当溶液中出现蓝色晶体沉淀时，可以挑选出适合测试的单晶.产率:89.0%.Tm.p.＞300℃.元素分析，测试:C，37.70;H，5.28;N，7.40%.计算(C12H20Cu N2O8):C，37.55;H，5.25;N，7.30%.FI-IR(KBr压片，υ/cm-1):1732 s，1617 s，1574 s，1329 m，1046 m，566m，475 m.

1.2.3 (Cu(C6H10NO4)2)晶体结构的测定

取0.30 mm×0.20 mm×0.06 mm的蓝色晶体置X-射线单晶衍射仪上，在293(2)K，采用石墨单色化的MoKa射线 (λ =0.710 73Å)作为衍射光源，扫描方式为φ和ω，在2.15≤θ≤25.99收集得到6 037个衍射点，其中2 841个为独立点，Rint=0.0568.所有数据均采用SADABSmulti-scan校正程序进行校正［7，8］，其中，对满足I＞ 2σ(I) 的 2841个点进行结构解析.晶体结构用直接法解得.对所有非氢原子坐标，使用全距阵最小二乘法进行各项异性温度因子修正［8-10］.对与N和C原子键合的H原子，采用骑跨式理论加氢.最终精修结果为:R1=0.0421，wR2=0.1028(见表1).

表1 (Cu(C6 H10 NO4)2)晶体学数据Tab.1 Crystallographic data of Cu(C6H10 NO4)2

1.2.4 催化三磷酸腺苷二钠水解的活性测试

催化三磷酸腺苷二钠水解的效果(活力大小)可用反应终止后反应液中无机磷(Pi)的含量确定［11，12］.而无机磷可与硫酸钼酸铵反应生成有色化合物，因此无机磷含量可用比色法测定.

无机磷标准曲线的绘制:在均加入了0.1 mL 20%三氯乙酸(TCA)、0.3 mL H2O的7支编号试管中分别加入 0.1 mL 的 0，10，20，30，40，50，60 mmol/L的Na2HPO3，再于各试管中加入2.5 mL硫酸钼酸铵-硫酸亚铁溶液，摇匀并测定OD660.测量5次/样品.以OD660为纵坐标，Pi浓度为横坐标绘制无机磷标准曲线.

(Cu(C6H10NO4)2)对三磷酸腺苷二钠的水解活性测定:通过测定混合体系的OD值，由无机磷标准曲线得到相应的无机磷含量值，即可判断出活性影响.具体操作为:分别取反应介质溶液0.4 mL于2支试管中，其中，一支试管中依次加入0.4 mL化合物溶液和1.0 mL溶剂，另一支试管中直接加入1.4 mL溶剂(作为参照液).室温下反应5 min后于2支试管中分别加入0.2 mL 20%TCA中止反应.吸取上述反应液各0.5 mL，再各加入2.5 mL硫酸钼酸铵-硫酸亚铁溶液.以参照液为对照，测定A660.其中反应液分别按下比例配制:

①反应介质溶液:50 mmol/L三羟基氨基甲烷(Tris)-HCl(pH=8.80)+5 mmol/L三磷酸腺苷二钠+20 mmol/L NaCl+100 mmol/L CH3OH;

②质量分数为10%的硫酸钼酸铵溶液:10 g钼酸铵 +100 mL 5 mol/L硫酸;

③硫酸钼酸铵-硫酸亚铁溶液:5 g硫酸亚铁 +10 mL 10%硫酸钼酸铵溶液+87.5 mL蒸馏水;

④待测目标化合物溶液配制:将待测目标化合物配成质量浓度约16 g/L溶液.

1.2.5 抗菌活性测试

化合物的抗菌活性测试，采用最小抑制浓度法(MIC).即在一定浓度梯度的化合物溶液中，加入菌种和培养基，让菌类在其中生长繁殖.通过观测溶液浑浊时对应的溶液浓度，即可得到最小抑制浓度值.

测试菌种为金黄色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus，Gram+)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli，Gram-)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis，Gram+)和普通变形杆菌(Proteus vulgaris，Gram-).培养基为Mueller-Hinton broth.L-谷氨酸-5-甲酯合铜溶液的以蒸馏水配成浓度分别为 1600，800，400，200，100，50，25μg/mL.溶剂水不呈现抗菌活性.

2 结果与讨论

2.1 合成和结构的光谱分析

(Cu(C6H10NO4)2)的合成采用了自组装条件，直接在相应的水溶液中制备得到.所得化合物易溶于水.元素分析的测量结果与理论计算结果相符.

(Cu(C6H10NO4)2)的红外光谱中，1732 cm-1处的强吸收峰，可指定为酯基中υas(C=O)特征吸收峰［13］.1617 cm-1处为 υas(COO-) 吸收峰，1329 cm-1为υs(COO-)吸收峰;与L-谷氨酸-5-甲酯中υas(COO-)、υs(COO-)谱峰相比［5］，均发生了移动，表明羧基与金属铜离子的成键.比较υas(COO-)、υs(COO-)谱峰，Δυ(COO-)=288 cm-1，因此可认为化合物中羧基是以单齿配位模式与金属离子成键的［14-16］.1046 cm-1处有 υ(C ― N)伸缩振动，与 L-谷氨酸-5-甲酯中 υ(C― N)伸缩振动相差 34 cm-1［5］;同时未见 υas(NH+3)、υs(NH+3)、δas(NH+3)及δs(NH+3)吸收峰，说明氨基中氮原子也参加了成键.此外，可认为566 cm-1和475 cm-1处的吸收峰分别为υ(N―Cu)和υ(O―Cu)伸缩振动［17］.

2.2 晶体结构分析

(Cu(C6H10NO4)2)的晶体属单斜晶系、P2(1)空间群，a=9.5883(19) Å、b=5.1521(10) Å、c=15.562(3)Å、β =98.65(3)°.其独立单元结构图和晶胞堆积图分别见图1和图2，主要的键长和键角见表2和表3.

图1 L-谷氨酸-5-甲酯合铜的结构Fig.1 Structure of copper complex of 5-methyl-L-glutamate

图2 (Cu(C6 H10 NO4)2)晶胞堆积图Fig.2 Packing diagram of copper complex of5-methyl-L-glutamate

表2 (Cu(C6 H10 NO4)2)中选择的部分键长Tab.2 Selected bond lengths of 5-methyl-L-glutamate

表3 (Cu(C6 H10 NO4)2)中选择的部分键角Tab.3 Selected bond angle(°)of 5-methyl-L-glutamate

(Cu(C6H10NO4)2)为单核四配位结构，每分子中含有2个 L-谷氨酸-5-甲酯配体.L-谷氨酸-5-甲酯配体通过羧羟基氧原子和氨基氮原子参加配位，形成一个“钳状”的平面构型［18］.配合物中心为CuN2O2，为平面四边形，其 O5—Cu1—O1和 N1—Cu1—N2键角分别为178.85(16)°和176.62(17)°，三个原子的连线近乎形成一条理想的直线.而O5—Cu1—N1、O1—Cu1—N1、O5—Cu1—N2 和 O1—Cu1—N2键角分别为94.79(15) °、84.23(13) °、84.77(14)°和96.24(15)°，这些角度与理想的正四边形90°稍有偏离，是由于与中心金属离子Cu(II)配位的氧原子和氮原子为2类不同的原子.配合物中的O2—C1—O1和O6—C7—O5键角分别为123.7(4)°和123.5(4)°，与配体中的键角125.9(3)°(O2—C1—O1)相比稍有减小，这与O1和O5原子参加了配位有关;而N1—C2—C1和N2—C8—C7键角分别为106.6(3)°和109.0(3)°，这与配体中的键角108.7(2)°(N1—C2—C1)相比变化不大.(Cu(C6H10NO4)2)中的 Cu—O键长1.944～1.947Å和 Cu—N键长1.980Å均为正常，与其它文献［19-20］中四配位铜的键长基本吻合.其中C1—O2、C1—O1、C7—O6 和 C7—O5键长分别为1.239(5)，1.282(5)，1.231(5)，和1.274(5)Å，与配体中的键长1.253(4)Å(C1—O2)和1.252(6)Å(C1—O1)相比明显变长，这是因为羧基中只有一个氧原子O1或O5参与配位，当氧原子配位后电子云偏向金属离子Cu(II)，使得C―O键减弱而键长增大，而另一个C—O键键长也因此略有伸长.C8—N2和C2—N1键长分别为1.479(5)Å和1.477(5)Å，与配体中的键长1.486(3)Å(C2—N1)相比，稍有变短［5］.

在(Cu(C6H10NO4)2)的晶体结构中，相邻的分子将通过分子间氢键(见表4)和远距离弱的Cu…O键形成一维链状结构聚集体(见图3).其中，Cu…O距离为2.824～2.858Å(O为未配位的羧羰基氧)，与正常Cu—O键键长相差约0.9Å(该分子中的Cu—O键长分别为1.944(3)Å和1.947(3)Å).这种拟变形八面体结构，也可视为Cu(II)的d9电子构型的J-T效应的结果.

图3 L-谷氨酸-5-甲酯合铜的1D结构Fig.3 1D Structure of copper complex of5-methyl-L-glutamate

表4 氢键的键长和键角Tab.4 Bond lengths and bond angles of Hydrogen

2.3 对三磷酸腺苷二钠水解反应的影响

在室温下，通过比色法测定的实验数据，从无机磷标准曲线中查出的配体L-谷氨酸-5-甲酯及配合物(Cu(C6H10NO4)2)体系的OD值所对应的无机磷含量，两者均无磷含量.因此对ATP水解反应，可认为L-谷氨酸-5-甲酯和(Cu(C6H10NO4)2)均无催化活性.

2.4 抗菌活性分析

(Cu(C6H10NO4)2)对金黄色葡萄糖球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽胞杆菌和普通变形杆菌的最小抑制浓度(MIC)见表5.由表5可见，除枯草芽胞杆菌外，(Cu(C6H10NO4)2)对其它测试微生物无抗菌活性.通常大多数化合物对Gram+菌的抗菌活性更强，但(Cu(C6H10NO4)2)对 Gram+菌与 Gram-菌的抗菌活性无区别.

表5 (Cu(C6 H10 NO4)2)的最小抑制浓度Tab.5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of copper complex of 5-methyl-L-glutamate

3 结语

以自组装的方法，在水溶剂中，用L-谷氨酸-5-甲酯和乙酸铜反应，合成了L-谷氨酸-5-甲酯合铜.对L-谷氨酸-5-甲酯合铜的X-射线单晶衍射测定表明，L-谷氨酸-5-甲酯合铜属单斜晶系，P2(1)空间群，其中a=9.5883(19)Å，b=5.1521(10)Å，c=15.562(3)Å;β=98.65(3)°.在晶体结构中，L-谷氨酸-5-甲酯合铜呈现为单核四配位结构，每分子中含有2个L-谷氨酸-5-甲酯配体.配体通过羧羟基氧原子和氨基氮原子参加配位，形成一个“钳状”的平面构型.在室温下，L-谷氨酸-5-甲酯合铜对三磷酸腺苷二钠的水解反应不表现活性;它对枯草芽胞杆菌具有较好的抑制作用，MIC=25μg/mL.

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