响应面法优化黑曲霉HQ-1产β-葡萄糖苷酶的固体发酵条件

张辉，张文会，孙中强

（聊城大学生命科学学院，山东聊城252059）

纤维素酶是降解纤维素β-1，4 糖苷键，使纤维素转变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。该酶系由内切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucan glucanohydrolase 或endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），外切葡聚糖纤维二糖水解酶（1，4-β-D-glucancellobilhydrolase 或exo-1，4-β-D-glucannase，EC3.2.1.91）和β-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21）三种主要成分组成[1]。纤维素酶的应用极其广泛，如能源、饲料、食品、纺织、造纸等诸多方面[2]。目前纤维素酶产生菌多为丝状真菌，主要包括木霉属（Trichoderma），曲霉属（Aspergillus），青霉属（Penicillium）和镰刀菌属（Fusarium）。其中，应用最广的以木霉属（Trichoderma）居多[3]。虽然该类菌能产生高活性的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，但β-葡萄糖苷酶的产量较低。因此，在纤维素被水解的过程中，由于β-葡萄糖苷酶的量不足造成纤维二糖过量积累，进而对酶的催化形成反馈抑制，造成纤维素水解效率不高[4]。因此，提高纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶的活力是提高纤维素酶的水解效率和葡萄糖得率的重要途径。黑曲霉是公认的安全菌株，也是产纤维素酶尤其是β-葡萄糖苷酶的高产菌株之一。

响应面法（Response surface methodology，RSM）是利用统计学技术，通过综合试验设计和分析数据，建立多元二次回归方程，可快速有效地对影响产量的各因素水平及其交互作用进行优化和评价[5-7]，已被广泛应用于各种生化反应、发酵条件优化以及模型的建立。

目前，国内外虽有关于优化黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵条件的报道，但主要侧重于液体发酵，优化方法多为单因素试验和正交试验，而对固体发酵条件的优化，尤其是利用响应面法进行优化的研究相对较少。因此，本工作以一株黑曲霉（Aspergillus niger）HQ-1 为出发菌株，利用响应面法对其产β-葡萄糖苷酶的固体发酵条件进行优化，并与相关研究进行了比较，旨在为高产β-葡萄糖苷酶菌株的开发和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

黑曲霉（Aspergillus niger）HQ-1，由本微生物实验室从腐烂的废纸中分离并保藏。

斜面培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA 培养基）；种子培养基（g/L）：葡萄糖15.0、酵母膏4.0、K2HPO42.0、MgSO4·7H2O 1.0、起始pH6.0；固体产酶培养基（500 mL 摇瓶盛放）：麦麸10.0 g、（NH4）2SO41.2 g、KH2PO41.2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、含水量60%、起始pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

取用PDA 斜面在28 ℃下培养7 d 后菌株，将灭菌的体积分数为0.02%Tween80 溶液加入斜面，制取浓度为5×106个/mL 的孢子液。取2.5mL 孢子液接入50mL种子培养基（用250 mL 摇瓶盛放），28 ℃，180 r/min 培养24 h 后得种子液，再将种子液以10%接种量接入固体产酶培养基（500 mL 摇瓶盛放），28 ℃培养96 h。

1.2.2 粗酶液的制备

称取5.0 g 发酵培养物，加入100 mL 醋酸缓冲液（50 mmol/L，pH6.0），180 r/min 振荡1 h 后过滤，取10 mL 滤液在10 000 r/min 下离心15min 后，取上清液即为粗酶液。

1.2.3 酶比活力测定

在试管中加入0.8 mL 的2 mmol/L 对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液（pNPG），然后加入1.0 mL 醋酸缓冲液（50 mmol/L，pH5.0），再加入0.2 mL 粗酶液后，在50 ℃水浴中反应10 min，再加入5.0 mL 的1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，于405 nm 波长处测吸光度，以不加底物而加等量蒸馏水为对照。

酶活力单位定义：1 秒钟水解对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）生成1 mol 对硝基苯酚所需的酶量为1 个活力单位（kat）。酶比活力用1 g 干重的发酵培养物所含的酶活力单位（μkat/g）表示。

1.3 试验设计

1.3.1 碳源和氮源的种类及含量对菌株产酶的影响

分别用麦秆粉、玉米秸秆粉、麦麸、不同比例的玉米秸秆粉/麦麸以及麦秆粉/麦麸为碳源，确定产酶的最适碳源后，分别添加不同量碳源，进一步确定碳源的最适含量。分别用（NH4）2SO4，NH4Cl，KNO3，尿素，酵母膏，蛋白胨为氮源，确定最适氮源后，再设定不同的氮源加入量培养并测定酶比活力，确定最适氮源含量。

1.3.2 Plackett-Burman 设计（Plackett-Burman design，PBD）

选 取 玉 米 秸 秆 粉，麦 麸，（NH4）2SO4，KH2PO4，MgSO4·7H2O，含水量，培养温度和起始pH 进行考察，选择高低两个水平，通过Minitab14 软件选用Factors=8，Runs=12 的Plackett-Burman 设计，以β-葡萄糖苷酶比活力作为响应值（设为Y）。通过比较各因素的显著性水平，筛选出对β-葡萄糖苷酶比活力影响较为显著的因素。

1.3.3 最陡爬坡试验

响应面拟合方程只有在考察的紧接邻域中才充分近似真实情形，要先逼近最大响应区域后，才能建立有效的响应面拟合方程[8]。最陡爬坡试验以响应值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各显著因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最大响应区域。

1.3.4 Box-Behnken 设计（Box-Behnken design，BBD）

用Box-Behnken 设计进行响应面试验，通过试验数据拟合响应面模型，得到二次多项式，并最终确定最佳发酵条件。二次多项式为描述响应量（应变量）和自变量关系的经验模型。对于3 因子系统，模型可描述为：

式中：Y 为预测响应值，X1、X2和X3为独立变量编码值；β0为截距，β1、β2和β3为线性系数；β11、β22和β33为平方系数；β12、β13和β23为交互作用系数。采用Minitab14软件和SASV8 软件对试验数据和模型进行分析。

2 结果与分析

2.1 碳源和氮源对产酶的影响

不同碳源和最适碳源的加入量对该菌产酶的影响分别见图1a 和图1b，结果表明，最适碳源为玉米秸秆粉/麦麸（1/1）。以玉米秸秆粉/麦麸（1/1）为碳源，最适添加量为12.0 g。玉米秸秆粉富含纤维素，是良好的诱导物和碳源。麦麸作为一种农业副产物，不仅含有纤维素，而且还含有淀粉、蛋白质及多种矿物质，可为菌株提供充足的营养成分[9]。不同氮源及最适氮源的加入量对产酶的影响见图2，结果表明，以12.0 g 的玉米秸秆粉/麦麸（1/1）作为碳源时，（NH4）2SO4为产酶的最适氮源，其最适含量为1.5 g。这是由于无机氮源中NH4+能被菌株直接利用，从而有利于菌体生长和产酶。

2.2 Plackett-Burman 设计

选用Factors=8，Runs=12 的Plackett-Burman 设计，设计及结果见表1，各因素代码、水平及回归分析见表2。

表1 Plackett-Burman 设计及结果Table 1 Design and results of Plackett-Burman Design

回归分析采用置信度为95%，P＜0.05 时表示影响显著，P＜0.01 时表示影响极为显著。各因素回归分析结果（表2）表明，含水量（P=0.003）、培养温度（P=0.014）和起始pH（P=0.026）对酶比活力的影响较显著，可作为主要影响因素进行最陡爬坡试验和响应面试验。由于其他因素的效应均为正效应，并根据单因素试验结果（图1b，图2b），在以后的试验中，玉米秸秆粉、麦麸、（NH4）2SO4，KH2PO4和MgSO4·7H2O 的加入量分别取6.0 g，6.0 g，1.5 g，1.6 g 和0.8 g。

2.3 最陡爬坡试验

含水量和培养温度呈显著正效应，应增加；起始pH 呈显著负效应，应减小。试验设计及各组酶比活力见表3，结果表明，β-葡萄糖苷酶比活力在第3 组达到最大值（8.095 μkat/g），因此，以第3 组作为响应面试验的中心点。

表2 Plackett-Burman 设计中因素代码/水平以及分析Table 2 Codes and levels of factors in Plackett-Burman design and estimate effects of factors on β-glucosidase specific activity

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Design and results of the method of steepest ascent

2.4 Box-Behnken 设计及分析结果

以β-葡萄糖苷酶比活力为响应值（设为Y），采用Factors=3，Runs=15 的Box-Behnken 设计进行优化试验。各因素编码、水平及结果见表4。

表4 Box-Behnken 设计的因素编码、水平及结果Table 4 Codes and levels of factors and results of Box-Behnken design

通过对数据进行二次多元回归拟合，得到二次多项式方程：

通过Minitab14 软件对试验数据和模型进行分析，采用置信度为95%、α=0.05，结果见表5。

可以看出，一次项、二次项对酶比活力影响显著，交互作用影响不显著。回归模型极为显著（P=0.000），失拟项不显著（P=0.107），说明模型与试验拟合良好。方程的决定系数R2为98.7%，表明仅有1.3%的差异不能被该方程解释。校正后的R2（Adj-R2）为96.4%，进一步说明该模型拟合程度良好。

依据回归方程，利用SASV8 软件绘出等高线图，结果见图3。通过SASV8 软件对方程式进行求导，得到含水量为73.4%（x1=-0.15849），培养温度为33.7 ℃（x2=-0.25931）和起始pH3.91（x3=-0.18811）时，β-葡萄糖苷酶比活力（Y）预测最大值为8.260 μkat/g。

表5 二次多项式模型的方差分析结果Table 5 Analysis of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

2.5 模型验证

单因素试验、Plackett-Burman 设计、最陡爬坡试验和Box-Behnken 设计的结果表明，优化后的发酵条件为：玉米秸秆粉6.0 g、麦麸6.0 g、（NH4）2SO41.5 g、KH2PO41.6 g、MgSO4·7H2O 0.8 g、含水量73.4 %、起始pH3.91、培养温度33.7 ℃；而未优化的发酵条件为：麦麸10.0 g、（NH4）2SO41.2 g、KH2PO41.2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、含水量60%、起始pH7.0、培养温度28 ℃。因此，将菌株分别在未优化和优化后的培养条件下进行产酶试验并进行比较，结果见表6。

表6 未优化和优化后黑曲霉（A.niger）HQ-1 的产酶历程Table 6 Time courses of enzyme production by A.niger HQ-1 under optimized conditions and unoptimized conditions

可以看出，培养96 h 后，优化后的酶比活力最高为8.244 μkat/g，比未优化的酶比活力最高值（1.700 μkat/g）提高了3.85 倍，并与方程预测值（8.260 μkat/g）较为接近。

3 讨论

和液体发酵相比，固体发酵具有成本低、产物浓度高、能耗少、所产发酵产物可直接作为酶的来源等优点以及能够克服液体发酵环境抑制微生物代谢的缺点。另外，本工作还采用廉价的玉米秸秆粉和麦麸作为诱导物和碳源，进一步降低了产酶成本。

本研究以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）为底物测定β-葡萄糖苷酶比活力，该方法是国内外常用的一种测定方法。经优化后，黑曲霉（A.niger）HQ-1 所产β-葡萄糖苷酶比活力最高为8.244 μkat/g，经换算后，高于国内外的相关报道，如Melanocarpus sp.MTCC 3922 的酶比活力为1.817 μkat/g[10]，嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）CBMAI-756 的酶比活力为1.167μkat/g[11]，嗜热子囊菌（Thermoascusaurantiacus）IMI 216529 的酶比活力为1.693 μkat/g[12]，土曲霉（Aspergillus terreus）M11 的酶比活力为2.133 μkat/g[13]，黑曲霉（Aspergillusniger）KK2 的酶比活力为1.667μkat/g[14]和烟曲霉（Aspergillus fumigatus Fresenius）的酶比活力为7.833 μkat/g[15]。

该菌株固体发酵产β-葡萄糖苷酶能力较强，因此，在以后的研究中，拟对该菌株所产β-葡萄糖苷酶进行分离纯化，探讨其酶学性质，以及对该酶编码基因进行克隆、序列分析及质粒转化以获得高效表达的工程菌。

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