一种检测发酵乳中嗜酸乳杆菌的定量定性方法

包秋华，李梅花，徐洁，张家超，张和平

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特010018）

嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）是一种人体肠道中的重要微生物，与人体健康息息相关，当其达到一定数量时，能改善或调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞的形成等，即起到健康促进效果[1-2]。目前国内外开发的含有嗜酸乳杆菌的乳制品种类繁多，且其多与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等多菌种混合发酵[3]。大量的研究表明，益生菌在进入消化系统后，其活菌含量必须达到1×106cfu/mL 以上才能发挥其健康功效，因此要求新鲜的益生菌制品中活菌数量不得低于1×107cfu/mL 才能补偿益生菌在通过人体胃肠道时活菌数的损失[4-6]。由此可见，乳酸菌数量是评价活性乳酸菌制品的重要指标[6]。但是目前我国对活性益生菌产品质量的监督力度不够，特别是对多菌复合的复杂样本中L.acidophilus 的定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法。传统方法易受培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限。PCR 技术和Real-Time PCR 技术具有特异性强、重复性好、准确、快速等优点，成为了微生物学领域检测的重要方法[7-10]。因此建立一种准确的定性、定量方法来分析评价发酵乳中是否存在L.acidophilus 及其中的有效活菌数势在必行。

1 材料和方法

1.1 标准菌株和样本来源

L. rhamnosus 1.2134、L. plantarum 1.2437、L. fermentum 1.188：中国普通微生物菌种保藏中心；L.acidophilus ATCC 4356、L.casei ATCC393：美国American Type Culture Collection；传统发酵乳酸奶样（25#和36#）：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室于2009年从西藏采的自然发酵乳样品。

1.2 试剂

大肠杆菌DH5α 为内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室保存；载体pMD-18T、Taq DNA polymerase、DNase I、反转录和实时定量的试剂盒（SYBRRPrimeScriptTMRT-PCR Kit，DRR063A，包括：DRR037S 和DRR041A）：大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）；Trizol 试剂盒：invitrogen 公司。

1.3 引物的设计

在Genbank 上下载嗜酸乳杆菌不同菌株及其他乳酸菌标准株的16SrDNA 序列，然后利用DNAStar 中MegAlign 进行序列比对，寻找种内保守区域，利用Primer 5.0 进行引物设计，并通过GenBank 中Blast 检测引物特异性，获得嗜酸乳杆菌的特异种引物。引物序列如下：上游引物Af 为5′-AGCTGAACCAACAGAT TCAC-3′，下游引物Ar 为5′-ACTACCAGGGTATCTA ATCC-3′，预计扩增片断长度为759 bp。

1.4 定性分析

采用反复冻融CTAB 法[11]提取发酵乳样品和部分乳酸杆菌（包括模式菌L.acidophilus ATCC 4356）的基因组DNA，纯化后稀释至100 ng/μL 备用。采用种特异性PCR 验证引物特异性，并检测自然发酵乳样本中是否含有L. acidophilus。反应体系25.0 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，共2.5 μL 5 mmol/L 上下游引物（Af 和Ar），1.0 μL 100 ng/μL DNA 模板，0.25 μL 5 U/μL Taq 酶（TakaRa），用二次蒸馏水补足至25.0 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性40 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环40 次；72 ℃延伸8 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶检测。

1.5 L.acidophilus 的定量测定

1.5.1 L. acidophilus ATCC 4356 的16S rDNA 基因的克隆

将L.acidophilus ATCC 4356 的PCR 产物与pMD-18T 连接转化DH5α 感受态细胞，经蓝白斑筛选、PCR、酶切分析等方法检测获得阳性克隆子pAT[12]。

1.5.2 外标准品的制备

提取以含有目的扩增片断的质粒pAT 总DNA，紫外分光光度计测定A 值后，计算出拷贝数，做10 倍系列稀释，梯度稀释至109～102拷贝数/μL 的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR 反应。

1.5.3 样本RNA 的提取和反转录成cDNA

按Trizol 试剂盒（invitrogen） 说明书提取样品RNA，然后用DNase I 处理一至两次，确保完全消除RNA 中的DNA 污染，得到纯化的RNA。反转录扩增按TaKaRa Code DRR037S 说明书进行，反转录扩增反应条件：37 ℃反应15 min；85 ℃变性5 s。

1.5.4 实时荧光定量PCR 和定量反应系统特异性评定

以待测样品cDNA 和外标准品为模板，用L.acidophilus 种特异性引物进行荧光定量PCR 扩增。荧光定量PCR 反应参数：95 ℃变性25 s；95 ℃变性10 s，56 ℃退火22 s，40 个循环。通过标准曲线和相应的计算机软件实现发酵乳中L. acidophilus 的快速定量检测。绘制融解曲线的范围从70 ℃缓慢升温至95 ℃，温度每升高0.5 ℃读一次荧光值，由IQ5 Real-Time PCR仪自动绘制融解曲线。

2 结果与分析

2.1 L.acidophilus 的种属特异性引物验证和定性检测

检测时一般认为阳性特征在759 bp 处出现预期扩增条带，说明此样本中含有L.acidophilus，阴性对照无特征条带，见图1。

图1 中泳道1 为pAT；泳道3 为模式菌L. acidophilus ATCC 4356；泳道4、5 为从西藏采的自然发酵乳25#、36#样本，结果为阴性，说明这2 份样本不含L.acidophilus。泳道6～9 为L.acidophilus 外的其他种乳酸菌，结果为阴性，说明引物特异性好，与预期结果一致。

2.2 快速定量检测L.acidophilus 的方法的建立

以不同拷贝数的阳性模板pAT 的对数为横坐标，以PCR 反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标得到嗜酸乳杆菌的标准曲线。待检样本25#、36#和外标样本同时进行实时荧光定量PCR，结果见图2。由图2 可见，Ct 值和拷贝数呈较好的线性关系，以初始模板量的对数为横坐标，Ct 值为纵坐标，绘制出的荧光定量PCR 标准曲线方程：Y=-3.582X+38（Y代表Ct 值，X 代表初始模板量的对数），初始模板浓度与Ct 值之间线性相关系数为0.987，斜率为-3.582，所建立的L.acidophilus 标准曲线符合Real-Time PCR 定量的要求。

SYBR GreenⅠ荧光定量反应系统特异性评定是通过分析PCR 产物的融解曲线来实现的，不同的PCR产物其融解曲线也不同，并可以排除引物二聚体等非特异性干扰，见图3。

由图3 可见，扩增产物的融解曲线一致，且都为单一峰型的曲线，证明荧光染料的定量反应系统特异性良好，引物和PCR 反映条件都适合进行荧光定量。

3 结论与讨论

本实验利用乳酸菌的16S rDNA 基因序列设计L.acidophilus 种特异性引物，以含有L. acidophilus 16S rDNA 基因的pAT 质粒作为阳性对照，通过种特异性PCR 和实时荧光定量PCR 反应建立了一种对多菌复合的复杂样本中L. acidophilus 的定性、定量检测方法，为益生菌产品的开发和质量监管奠定了基础。本实验结果表明：所设计嗜酸乳杆菌引物特异性较好；定性方法可以直观的从图上看出待测菌是否含有嗜酸乳杆菌，与传统的生理生化鉴定相比既简便又准确；绝对实时荧光定量方法的优势在于能够对复杂样本中某一种菌进行准确定量。实验过程中发现RNA 易降解，最好采用核酸提取仪破碎原始样本中的细胞，比液氮研磨法提取的RNA 损失小，准确率高。

[1] Suskovic J,Kos B,Matosic S,et al.The effect of bile salts on survival and morphology of a potential probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92 [J]. World journal microbiology biotechnology,2000,16(7):673-678

[2] 郭本恒.益生菌[M].北京:化学工业出版社,2003:93-126

[3] 刘希山,罗欣,梁荣蓉,等.嗜酸乳杆菌与嗜热链球菌混合培养制作保健型发酵乳的研究[J].中国食物与营养,2005(10):34-37

[4] Stanton C,Gardiner G,Meehan H,et al. Market potential for probiotics[J].An J Clin Nutr,2001,73(2 Suppl):476S-483S

[5] Roy RHD,Gauthier SF. Production of Oligosaccha-redesin yougurt containing bifidobacteria and yogurt cultures [J].Journal of dairy science,2002,85(5):1058-1069

[6] 方改霞,单林娜,李慧,等.多菌种酸奶中活性乳酸菌的计数方法研究[J].微生物学杂,2009,29(3):101-104

[7] Haarman M,Knol J. Quantitative real-time PCR analysis of fecal Lactobacillus species in infants receiving a prebiotic infant formula[J].Applied environmental microbiology,2006,72(4):2359-2365

[8] 朱宝玉,张秀丽,廖兴广,等.活性乳酸菌制品中乳酸菌计数条件的优化研究[J].中国卫生检验杂志,2004,14(5):561-563

[9] Friedrich U,Lenke J.Improved enumeration of lactic acid bacteria in mesophilic dairy starter cultures by using multiplex quantitative real-time PCR and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization[J].Applied environmental microbiology,2006,72(6):4163-4171

[10] 赵文静,李妍,高鹏飞,等.实时定量PCR 技术在乳酸菌定量检测中的应用[J].食品与生物技术学报,2009,28(4):433-437

[11] F 奥斯伯,R 布伦特编.颜子颖, 王海林译.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,1998:37-39

[12] 萨姆布鲁克J, 拉塞尔DW 著.黄培堂主译.分子克隆实验指南[M].3 版.北京:科学出版社,2002:68-105