幽门螺杆菌蛋白晶体结构的研究与应用

宫雅楠，张建中

幽门螺杆菌蛋白晶体结构的研究与应用

宫雅楠，张建中

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称H．pylori或Hp）是微需氧的革兰氏阴性菌，并引起严重的胃十二指肠疾病，例如消化性溃疡、胃炎及胃癌等，WHO将其确定为I类致癌因子［1］，世界人口中约半数处于慢性感染状态。由于其严重的致病性，近来关于机制的研究及药物开发受到更多的关注，蛋白晶体结构的研究与应用更是成为一个关注的焦点。

1 幽门螺杆菌蛋白结构分析中的研究方法

电子显微镜（EM）主要用于细菌形态的研究，目前常用于分析Hp的表面结构。新近发展起来的低温电镜技术（cryo－genic EM）是低温冷冻技术与电子显微镜相结合，可以获得更精细的细菌结构，甚至可获得生理状态下细菌的内部结构［1］，但这些方法都无法获得原子水平的蛋白结构。

20世纪末，随着分子生物学技术的发展，细菌蛋白的表达及纯化变得相对容易，从而使进一步从原子水平上研究细菌蛋白结构及功能成为可能，主要包括核磁共振技术及X射线衍射技术。

核磁共振技术（NMR）可用于测定蛋白的液相结构，NMR测定曾被用于Hp0222蛋白在溶液中的液相机构，并发现其以二聚体形式存在，结构由带－螺旋－螺旋方式组成，具有转录调节因子的ARC／METJ家族特性，都能与DNA结合形成高级有序寡聚体［2］。而对Hp0892的溶液结构分析发现其含有3个α－螺旋，5个β－股形成一个5股β－折叠片，它属于质粒稳定系统蛋白家族。NMR仅限于分子量不大于30 kd～40 kd小分子蛋白的分析，且所得到的信息不能被现有的其它分析技术解译［3］。

X－射线衍射技术目前应用广泛，通过这种方法已经测定出大量蛋白的三维结构。它是基于蛋白结晶的重要结构分析方法，能够对蛋白形成的晶体进行X－射线衍射分析，从而可在原子水平上认识蛋白结构。蛋白晶体生长环境中一般含有30%～90%的溶剂，有助于维持蛋白的天然构象，使蛋白结构及功能的推测与研究更具有可靠性［1］。

Hp蛋白的三维结构解析是认识其蛋白功能及致病机制的有力手段，对其结构的认识经历着电镜结构到其组成蛋白原子水平3D结构的变化。目前通过X－射线衍射技术已获得上百种幽门螺杆菌蛋白的晶体结构，对其蛋白功能、致病机制、免疫机理及药物设计提供了重要技术支持。

2 Hp蛋白晶体结构分析用于蛋白功能研究

已有大量Hp蛋白通过与其他生物或微生物已知功能蛋白的序列比对推测出其功能并通过生化实验得以验证，其独特的三维结构决定了它们功能的多样性及复杂性，因此结构的测定能够更好地了解这些蛋白的功能特性。

Hp细菌定植及持续感染机制相关研究发现，大量蛋白参与其中，但这些蛋白大多在功能上是未知的，晶体结构成为揭示其功能的有力手段。Hp1286与Hp1287（ten A）都与定植相关，晶体结构分析发现Hp1286为对称二聚体，属于YceI－类似蛋白家族，可能具有一些长链脂肪酸或酰胺的贮存及转运功能，能够吸收环境中的脂肪酸或酰胺，为细菌代谢提供必需的脂肪酸，或保护细菌免于受到脂肪酸抗菌活性的毒性作用［4］；发现Hp1287能形成222对称同源四聚体，属于硫胺素酶II家族，参与硫胺前体羟嘧啶合成的补救途径中，构成了硫胺生物合成的一个模块，但其对底物4－氨基－5－氨甲基－2－甲基嘧啶的活性稍差［5］。

Hp蛋白晶体结构的测定也被用于揭示蛋白的活性作用位点及关键氨基酸残基部位。尿素酶成熟蛋白（UreE）与Cu2＋及Ni2＋结合的晶体结构分析表明，UreE与离子结合后形成四聚体，通过His102排列围绕在金属离子周围。与His102的结合能够增加局部金属离子的浓度，从而可传递更多的镍离子［6］。甲酰胺酶AmiF的晶体结构揭示出甲酰胺结合袋由Cys166、Glu60和Lys133残基组成，其中Cys166是亲和基团，C166S突变体可导致蛋白失活［7］。

在Hp的全部蛋白中大约1／3的蛋白没有寻找到序列上的同源物，它们的功能及三维结构从未被描述过。对这些蛋白的理解对潜在抗菌药物的发现提供基础，其功能及结构测定受到更多的关注。例如Hp0336基因编码一种富含半胱氨酸的蛋白Hcp B，其结构包括四个α／α－基序，通过二硫键交连起来。重复子与三四氨基酸重复基序（tetratricopeptide repeat，TPR）相似，许多TPR蛋白参与到细胞周期调节，蛋白转运，以及分子伴侣协助蛋白折叠中，因此基于整体结构推测Hcp B也可能具有这些功能［8］，但对这些功能的深入认识，还有待于对其晶体结构的分析。

3 蛋白晶体结构分析用于Hp进化研究

通过比对Hp蛋白与其它物种蛋白间序列上的相似性程度，不仅能够推测出蛋白可能的生物学功能，也能用于进化及分型研究。Hp有许多蛋白并未发现存在序列上的同源物，因此对其空间结构的分析和比对具有更重要的意义。

Hob A（Hp1230）能够特异地与Dna A蛋白相互作用，通过晶体结构测定揭示了它具有糖异构酶（sugar isomerase，SIS）蛋白结构域，SIS蛋白与大肠杆菌的Dia A蛋白序列高度同源，但Hob A与大肠杆菌Dia A没有序列同源性，结构比对发现它们二聚体／二聚体界面也是不同的，但具有相似的折叠方式，均为DNA复制调节因子，但Hob A已进化成Hp的存活必需因子［9］；YbgC（Hp0496）与大肠杆菌YbgC在序列上有30%的相似性，但具有相似的硫酯酶特性的热狗折叠结构，揭示了ε－γ四聚体组装形式在YbgC蛋白中是保守的，这种独特的四聚化形式产生一个重要表面，由12股β－折叠片组成产生，这些区域能够参与到特定相互作用，包括与Cag A的相互作用。基于其活性以及与大肠杆菌YbgC结构的比对，提出YbgC的催化核心是保守的，可能参与到脂酰辅酶A衍生物的水解［10］。

4 致病因子晶体结构与Hp致病机制研究

Hp致病性相关的因子包括空泡细胞毒素（Vac A）、细胞毒性相关蛋白 A （Cag A）、表面脂多糖LPS、尿素酶、鞭毛蛋白、粘附素等。

4．1 运动及趋化性因子 运动能力是通过极生鞭毛来完成的，对定植是必需的。鞭毛也参与到粘附及诱导宿主细胞炎症应答中。由于运动性是毒力相关特性，改善了对鞭毛生物合成的理解，有利于发展干扰或治疗策略［11］。

Hp鞭毛由2种鞭毛蛋白组成：FlaA和FlaB［12］。fla A1（Hp0840）基因产物能够参与到鞭毛及LPS的合成，在Hp致病性及定植中起关键作用。fla A1基因的破坏可导致细菌鞭毛缺失即LPS缺失大部分O抗原结构。FlaA1序列表明它属于短链脱氢酶／还原酶超家族，通过测定Fla A1·NADPH．UDP－Gal、Fla A1·NADP＋·UDP－Glc NAc、Fla A1·NADP＋·UDP－Glc、Fla A1·NADPH·UDP－Glc NAc及FlaA1·NADP＋·UDP－Gal 5种不同三元络合物的晶体结构，表明此酶以六聚体形式存在，是一种新的短链脱氢酶／还原酶超家族成员，其催化唾液酸类似物pseudaminic acid（Pse）衍生物合成途径的第一步，Pse与鞭毛糖基化相关，对功能性鞭毛的组装是必需的［13］；Hp0366基因编码的氨基转移酶（PseC）在Pse生物合成途径中起核心作用，同源二聚体构成活性位点，并鉴定出参与到中间体稳定与催化的关键残基。进一步基于结构的定点突变证实了在催化过程中lys183的关键作用，能够帮助解释Pse生物合成途径中氨基转移酶反应机制［14］。

趋化性是Hp定植与感染的另一重要毒力因素。Hp的趋化系统的标志是多个感应调节因子的存在，包 含 CheY（Hp1067）、Che A（Hp0392）、CheW（Hp0391）以及较远的 Hp0170基因编码CheZ同源物。通过与大肠杆菌Bef－结合CheY活性位点残基间的结构比对表明thrf 84在磷酸转移反应中起重要作用，这是首次对Hp趋化系统的特性提供结构上的观点［15］。已测定出的Bef3－活化的趋化蛋白Hp CheY1晶体结构，揭示了Bef3与Che Y1的结合机制，以及Bef3－Che Y1与Hp Fli M的相互作用的结构基础。

4．2 Vac A及肿瘤诱发因子 Vac A是Hp分泌的一种细胞毒素，能够引起哺乳动物细胞质内广泛的空泡形成及多种细胞内效应。Vac A包含P33和P55两个结构域，二者的结构域组分对Vac A寡聚化是必需的，其中P55结构域在调节Vac A结合宿主细胞中起重要作用，其显著特性是存在一个由卷曲β－折叠片组成的右手平行螺旋状结构，这是自主运载体结构域的典型特征，在已知的细菌蛋白毒素中具有独特性。P55的结构特性还包括β－折叠片接触的断裂，导致5个β螺旋状亚结构域形成，同时还含有1个二硫键的C－端结构域［16］。

在此基础上，所构建的8个P55结构域缺失突变体分析结果表明在Vac A P55结构域的β螺旋状片段中有一些灵活区域能够耐受变化而对蛋白分泌或活性无毒性效应，同时发生相似改变的C－端结构域导致蛋白错误折叠和分泌损伤，证明非必需β螺旋状卷曲以及C－端β螺旋状片段对蛋白正确折叠是必需的，而大部分P55结构域对于Vac A毒素活性都不是必需的［17］。

肿瘤坏死因子－α（TNF－α）是肿瘤诱发的关键细胞因子之一，能够诱导TNF－α的Hp蛋白，TNF诱导蛋白（Tipα），在胃癌发生中起重要作用。Tipα从Hp中以二聚体形式分泌，亚单位间通过二硫键连接，能够进入胃黏膜上皮细胞，其单体包含两个结构域组成（复合结构域及螺旋结构域），由4个α－螺旋，3个β－片层以及多个环组成。每个单体都有一定程度的伸长及弯曲，结构揭示其DNA结合新的折叠方式，2个单体间螺旋1，2间环所形成的阳离子表面对DNA结合非常重要［18］。

此外，通过构建出缺少N端6个氨基酸残基LQACTC的Tipα突变体，对缺失2个半胱氨酸C5和C7缺失突变体的晶体结构分析发现，缺失后的Tipα具有一种新的延伸结构，含有一个40Å长的α－螺旋，通过非共价键形成一个心型同源二聚体，这种折叠方式与Tipa同源二聚体非常相似，其独特的二聚体形式对蛋白与蛋白间的相互作用以及Hp感染的致癌性机制提出新的观点［19］。

4．3 金属代谢相关因子 铁是Hp生存的必需因子，参与到铁代谢的蛋白均为重要的毒力因子。Hp铁蛋白Hpf可控制菌体内可溶铁的含量，保护细菌不受到酸放大铁毒性的损害。与其它铁蛋白家族成员相似，Hp铁蛋白也是以2，4亚单体球蛋白外鞘形式组装，其中每个单位都折叠成4α－螺旋簇，在低含量铁结合状态下构象无变化，但在中含量及高含量铁结合状态下，BC环及4折叠对称通道入口处的his149咪唑环发生明显的构象变化，表明铁离子能与折叠通道中心结合，这与哺乳动物铁蛋白不同。这些不同状态下Hpf晶体结构的测定可以更好地理解铁吸收及释放的机制［20］，从而进一步加深对Hp致病机制和慢性感染机制的认识。

4．4 氧化应激因子 过氧化物歧化酶（SOD）是氧化应激的关键酶，Hp能产生一种SOD（Hp SOD），在2．4Å分辨率下测定的SOD晶体结构是由两个相同亚单位组成的二聚体，每个单体含有一个铁离子。它与大肠杆菌中的对应酶间具有53%的序列相同性。与其它二聚化含铁的SOD相比，包括金属核心在内的主要Fe－SOD活性位点都是保守的，二聚体界面的特定相互作用模式也非常保守。结构差别主要集中在与亚单位界面较远的区域，其中最关键的是一个由延伸的，由α－螺旋组成的20个氨基酸残基构成的C端尾巴的存在，这个结构可能成为一种新的结构模型，推测这个延伸的C端可能与Hp SOD吸附细胞表面有关，Hp SOD可能在这个发生区域磷酸化［21］。

5 Hp蛋白晶体结构与抗菌药物设计

在研究Hp蛋白质结构与功能过程中发现较多个潜在的抗菌药物靶位，其中多数为代谢酶类。例如，腈脒合酶（PAPT）在腈脒生物合成过程中起作用，它由N端β股结构域及C端Rossmann类似结构域组成。两个结构域间有一个独特的结合袋、大量非保守残基以及一个大的埋入空间。它对细菌生存是必需的，因此基于其典型的PAPT序列及不同的构象可作为潜在的抗菌药物靶位［22］；此外还有丙二酸单酰辅酶A：酰基载体蛋白转酰酶（Malonyl－Co A：acyl carrier protein transacylase，MCAT），与其它物种的晶体结构具有高度相似性，是高度保守酶，也可作为抗菌药物的靶位［23］。

细菌L－天冬酰胺酶已经用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病30多年了，其治疗效应基于它们能够催化肿瘤必需氨基酸L－天冬酰胺转变成L－天冬氨酸和氨。2种L－天冬酰胺酶，大肠杆菌及欧文菌属，已经作为抗白血病药物广泛应用于临床实验。但由于它们潜在的谷氨酰胺酶活性，L－天冬酰胺酶也能够引起严重副反应。Hp的L－天冬酰胺酶HPA具有可忽略的谷氨酰胺酶活性，结构比对表明HPA与大肠杆菌的L－天冬酰胺酶结构更加相似［24］，提示可能具有更好的药物研发前景。

6 展 望

蛋白分子的功能特性主要取决于它独特的三维空间结构，X射线衍射是确定晶体三维结构最可靠的方法，但获得蛋白质晶体仍是这一领域的主要技术瓶颈之一。Hp编码蛋白中仍有大量蛋白，尤其是外膜蛋白，没有获得其结构分析结果。Hp外膜蛋白在细菌定植及免疫反应中发挥重要作用，其中几种已经鉴定为粘附素，与致病性相关。但由于膜蛋白的疏水性及表达量低等因素制约着结构研究的发展。近来，随着分子生物学先进技术以及蛋白纯化系统的应用，使得获得大量活性蛋白质变得容易，这为蛋白晶体的生长提供了基础。目前蛋白结晶技术迅速发展，大量新技术与结晶新产品广泛使用，例如Hampton Research及Qiagen等公司不断推出蛋白晶体生长条件筛选的试剂盒，建立了上千种不同筛选条件。脂立方相（LCP）法是逐渐发展起来的膜蛋白结晶方法，同时也产生了一系列立方相结晶试剂，确保全自动地、高通量膜蛋白结晶。蛋白结构的获得不仅有助于理解单个蛋白作用的机制，对其作用配体筛选、免疫机理研究、抗菌药物及疫苗的发展都具有重要的意义。

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R378．2

A

1002－2694（2012）02－0148－04

张建中，Email：zhangjianzhong＠icdc．cn

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室，北京102206

2011－10－17；

2011－11－25