冷冻原肠中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的研究＊

仇保丰，蔡宝亮，宋鸿雁，刘文斌，高逢结，顾炳泉，李 建

冷冻原肠中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的研究＊

仇保丰1，蔡宝亮2，宋鸿雁3，刘文斌1，高逢结1，顾炳泉1，李 建1

目的检测分析进出境冷冻原肠携带肠出血性大肠杆菌O157∶H7的情况。方法对2010－2011年进境或国产的35份冷冻原肠样品（包括19份冷冻羊原肠和16份冷冻猪原肠）进行检测，根据细菌的培养特性、生化鉴定和血清学鉴定，同时设立标准菌株作为对照。结果2份原肠样品检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7，检出率为5．71%。结论进境和国产原肠均有可能携带肠出血性大肠杆菌O157∶H7，应该加强监测。

冷冻原肠；肠出血性大肠杆菌O157∶H7；检测

肠衣（Casing）是家畜新鲜肠管经加工处理，除去肠内外各种不需要的组织后所剩下的一层坚韧、半透明的薄膜，它是加工灌肠类食品的重要原料之一。我国是世界上主要肠衣生产国，同时也是肠衣来料和进料加工大国。肠衣产业为解决我国出口创汇、农民增收和增加就业等发挥很大作用，但是，肠衣也容易携带多种病原微生物，特别是去粪、清洗后未经刮制的原肠（Intestine），更容易携带和传播病原体［1－2］。这一方面会对公共卫生安全和畜牧业发展造成威胁，另一方面也会给我国肠衣出口行业带来冲击，尤其是近年来随着人们对食品安全的高度重视和国际贸易技术壁垒的影响，国内外对食品微生物的检测要求也日益严格，我国肠衣行业有可能会遭受严峻考验。

肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7是一种新发现的肠道致病菌，它对人类健康的危害已引起世界各国的普遍关注。我国每年生产和引进大量动物原肠，存在着携带和传播EHEC O157∶H7的风险。但是，目前国内外对原肠携带EHEC O157∶H7的研究很少。对2010－2011年进出境的19份冷冻羊原肠和16份冷冻猪原肠携带EHEC O157∶H7的情况进行检查，旨在获得动物原肠携带EHEC O157∶H7的第一手资料。

1 材料与方法

1．1 材料 肠出血性大肠杆菌O157∶H7标准菌株（ATCC35150）由青岛绿谷有限公司购买；m（EC）n、SMAC、LST－MUG肉汤、O157菌成套生化鉴定管（用于大肠杆菌O157∶H7／NM生化鉴定）均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；肠道埃希氏菌O157∶H7标准血清购自宁波天润生物药业有限公司。

1．2 肠衣样品的采集 35份进境或国产冷冻原肠样品，为2010－2011年在南通肠衣生产、加工企业采集，其中包括19份冷冻羊原肠和16份冷冻猪原肠。样品采集方法如下：在冷冻原肠解冻后，迅速从包装容器不同位置随机选择尽可能多的肠衣，分别用高压灭菌处理过的剪刀和镊子无菌采集约5g样品放入无菌的均质袋中，直到每份样品的总量不少于1 000 g，密封均质袋口放入未经使用的取样袋内，扎经取样袋再放入盛有冰袋的保温盒内，密封后尽快送往实验室并于－18℃冻存。

1．3 样品的处理及细菌的培养和纯化 肠衣样品采集后尽快进行EHEC O157∶H7增菌培养、选择培养和纯化培养：先将样品由冰箱拿出后置室温解冻，在无菌操作台内打开包装袋，用灭菌处理过的剪刀和镊子充分剪碎、混匀后，分别按照文献［3］的方法对冷冻原肠中的EHEC O157∶H7进行分离和纯化，同时设立标准菌株作为对照。

1．4 原肠携带大肠杆菌的鉴定 将1．3分离、纯化获得的EHEC O157∶H7可疑菌落分别按照文献［3］的方法，用O157菌成套生化鉴定管和肠道埃希氏菌O157∶H7标准血清进行生化和血清学鉴定，根据鉴定结果做出判定。

2 结 果

2．1 EHEC O157∶H7的分离 35份冷冻原肠样品分别按照文献［3］的方法对其进行增菌培养、选择培养和纯化培养。对于不发酵山梨醇并在MUGLST发酵管内出现产气的菌落，用接种环取少量菌液在普通琼脂平板上划线培养，然后挑取单菌落接种TSI，根据培养结果将EHEC O157∶H7可疑细菌进行进一步的鉴定。

2．2 EHEC O157∶H7的鉴定 对35份样品中分离到的EHEC O157∶H7可疑细菌用O157菌成套生化鉴定管和肠道埃希氏菌O157∶H7标准血清进行生化试验和玻板凝集试验，有2份冷冻原肠样品的EHEC O157∶H7检测结果呈现阳性，阳性率为5．71%。

3 讨 论

目前，欧盟和加拿大等国家和地区对我国出口肠衣的兽药残留制定了严苛的限量指标，并要求做到每批检测，极大地增加了出口的难度和负担。但是，国外对肠衣携带致病菌的问题却不够重视。究其原因，我国出口的绝大多数肠衣是已经加工为成品的盐渍肠衣，而国外的大量研究表明，绝大多数细菌在盐渍肠衣的这种高渗环境下经过一段时间（约30d）就会被杀灭［4－6］。再加之出口到国外的肠衣除了要经过长时间的海上运输外，到达国外还需要再次加工和蒸煮才供食用，因此国外对肠衣携带致病性微生物的问题并不苛求。

我国作为肠衣出口主要国家，一方面，在国内屠宰场和肠衣企业间大批量、远距离的运输来自全国各地的冷冻肠衣，存在着传播动物疫病和危害公共卫生安全的巨大隐患。另一方面，因为劳动力成本低廉，我国还是世界上重要的肠衣来料和进料加工大国，每年有大量的来自不同地区和国家的冷冻肠衣涌入国内，很容易将国外的动物疫病带入国内，给我国畜牧养殖业和肠衣从业人员的健康带来威胁。因此，对冷冻原肠携带微生物的情况进行系统、全面的检测控制已经非常迫切。刘增再等对湖南某肠衣出口企业的40个盐渍猪肠衣样品携带猪瘟病毒进行检测，CSFV阳性率为7．5%［7］。对于冷冻原肠携带致病菌的研究，国内目前尚未见报道。本研究选择19份冷冻羊肠衣和16份冷冻猪肠衣作为检测样品，结果发现2份有致病菌，EHEC O157∶H7检出率为5．71%。

［1］Chawla SP，Chander R，Sharma A．Safe and shelf－stable natural casing using hurdle technology［J］．Food Control，2006，17：127－131．

［2］Gabis DA，Silliker JH．Salmonella in natural animal casings［J］．Appl Environ Microbiol，1974，27（1）：66－71．

［3］SN／T 0973－2000进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7检验方法［S］．北京：中国标准出版社，2001．

［4］Wijnker JJ，Koop G，Lipman LJA．Antimicrobial properties of salt（NaCl）used for the preservation of natural casings［J］．Food Microbiol，2006，23：657－662．

［5］Benli H，Hafley BS，Keeton JT，et al．Biomechanical and microbiological changes in natural hog casings treated with ozone［J］．Meat Sci，2008，79：155－162．

［6］Jo C，Lee JW，Cho KH，et al．Quality properties of sausage made with gamma irradiated natural casing from intestine of pork or lamb［J］．Radiat Phys Chem，2002，63：365－367．

［7］刘增再，朱中武，唐连飞，等．盐渍肠衣猪瘟病毒实验室检测的相关性研究［J］．湖南农业大学学报（自然科学版），2005，31（6）：644－647．

Investigation on eEnterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7 in frozen intestine

QIU Bao－feng1，CAI Bao－liang2，SONG Hong－yan3，LIU Wen－bin1，GAO Feng－jie1，GU Bing－quan1，LI Jian1
（1．Nantong Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nantong 226018，China；2．Jiangsu Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China；3．Laboratory Animal Center of Nantong University，Nantong 226001，China）

To study the enterohemorrhagic Escherichia coli（EHEC）O157∶H7 in entry－exit frozen intestines，35 intestine samples，which included 19 samples derived from lambs／sheep and 16 samples derived from hogs，were collected in imported or domestic products during 2010－2011．Based on bacterial properties，biochemical and serological confirmation，and a EHEC O157∶H7 reference strain was prepared as well，it shows that 2 frozen intestine samples were contaminated with EHEC O157∶H7，positive rate was 5．71%．Imported or domestic intestines might be contaminated with EHEC O157∶H7，the relevant supervision and study should be strengthened．

frozen intestines；EHEC O157∶H7；detection

R378．2

A

1002－2694（2012）02－0191－02

＊江苏检验检疫局科研项目（No．2010KJ35）资助

仇保丰，Email：baofengqiu2008＠yahoo．cn

1．南通出入境检验检疫局，南通 226018；2．江苏出入境检验检疫局，南京 210001；3．南通大学实验动物中心，南通 226001

2011－09－18；

2011－10－23