腹泻仔貉检出携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌＊

张艳英，史秋梅，房 海，陈翠珍，刘亚君，杨月琳

腹泻仔貉检出携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌＊

张艳英，史秋梅，房 海，陈翠珍，刘亚君，杨月琳

目的为了解大肠杆菌引起仔貉腹泻的机理，进行了小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因的检测，并对其菌株作毒力试验。方法用PCR扩增法检测毒力岛基因irp2和fyua，小鼠腹腔注射检测菌株毒力。结果从3个貉场腹泻病死貉脏器以及粪便中分离出血清型分别为O23和O20的大肠杆菌，对两血清型大肠杆菌进行毒力岛检测，均检出携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyu A。2个血清型O23、O20大肠杆菌均分别使小鼠发病死亡。结论仔貉腹泻是由携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyua的大肠杆菌引起，该菌对仔貉的健康具有潜在的威胁。

腹泻；毒力岛基因irp2和fyua；小肠结肠炎耶尔森菌；仔貉

毒力岛（pathogenicity island）是细菌染色体上编码毒力基因簇，最早发现于耶尔森菌属，因与该属菌的小鼠致死表型密切相关，故被命名为耶尔森氏菌强毒力岛（HPI）［1－3］。目前，已在沙门菌、志贺菌、O139霍乱弧菌、幽门螺杆菌、泌尿道致病性大肠杆菌等细菌也发现具有毒力岛存在［4－6］，毒力岛具有稳定性和不稳定性及潜在的可移动成份，毒力岛和新病原菌的产生有着密切联系［4－5］。国内外研究表明，HPI可在耶尔森氏菌和大肠杆菌之间水平传播［7－9］，与致病性大肠杆菌的毒力进化密切相关。HPI约102 kb，由许多功能相关的基因组成，其中irp2、irp1、fyua基因是HPI核心区的主要结构基因［10］，irp2可作 为 HPI的 检 测 标 志［11－12］。1998 年Schubert等［13］报道，在93%肠黏附性大肠杆菌（Enteroadherent E．coli，EAEC）、5%的肠致病性大肠杆菌（Enteropathognic E．coli，EPEC）和肠产毒性大肠杆菌 （Enterotoxingenic E．coli，ETEC）、20%的肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E．coli，EIEC）中具有小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛的irp2基因等。为了解大肠杆菌引起仔貉腹泻的机理，进行了小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因的检测，并对其菌株做毒力试验。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 供试菌株 2011年6－8月份，秦皇岛市区各县养貉场的乌苏里仔貉流行1种腹泻，仅昌黎县各貉场发病率35%（35场／100场），貉场内仔貉发病率31%～40%（155只／500只～200只／500只），有的仔貉腹泻后死亡。我们对来自3个貉场死亡的仔貉以及腹泻粪便标本进行了检测，从病死仔貉脏器、小肠、腹泻粪便中分离的细菌，编号为H1、H2。1．1．2 序列比对参考菌株 E．coli APEC O1收录号CP000468．1，E．coli O7收录号 CP003034．1，E．coli O26：H11收录号 AP010953．1，E．coli O42收录号 FN554766．1 及 E．coli O83：H1 收 录 号CP001855．1。

1．1．3 主要试剂 树脂型TM基因组DNA提取试剂盒（北京赛百盛基因技术有限公司），Dream TapTMGreen PCR Master Mix 2×（Fermentas公司），DNA Maker（东盛生物有限公司）；毒力岛基因引物（上海生工生物工程技术有限公司合成），大肠杆菌O因子血清（中国兽医药品监察所，有效期2013年10月），麦糠凯培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖等各种生化鉴定管（由北京陆桥有限技术责任公司），药敏纸片北京天坛药物和其他试剂均按常规方法配制。

1．1．4 主要仪器 PCR扩增仪（东胜创新生物科技有限公司），TGL－16G台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂），DYY－6C电泳仪（北京市六一仪器厂），ZHWY－103B恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司），BIO－BEST200E凝胶成像分析系统（美国西盟国际公司）。

1．1．5 实验动物 小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 分离培养及生化鉴定 将腹泻病死仔貉肝脏、脾脏、小肠内容物及其粪便分别划线于SS和麦康凯平板中，经37℃24h培养后，每个平板挑取优势菌落5～10个接种于克氏双糖管中，在克氏双糖管阳性，H2S阴性及动力阳性的，做系统生化实验。1．2．2 血清型鉴定 挑取优势菌落编号为H1、H2菌株接种于普通琼脂斜面小管，置37℃培养24h，用0．5%的石碳酸生理盐水2 m L洗下普通琼脂斜面培养物，制成浓稠菌悬液，高压下灭菌2 h，破坏其“k”抗原，制成高压抗原。用各种标准单因子血清进行玻板凝集反应，同时以抗原与0．5%石碳酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝现象。30 s内出现明显的凝集（＋＋）判为阳性。

1．2．3 分子生物学鉴定

1．2．3．1 基因组DNA的提取 挑取优势菌落编号为H1、H2菌株接种于LB培养基摇菌后，用树脂型TM基因组DNA提取试剂盒（北京赛百盛基因技术有限公司）进行基因组的提取，取3μL基因组DNA进行电泳（1%琼脂糖、384V／30min）。－20℃保存备用。

1．2．3．2 引物设计

irp2：上 游 引 物：5′－AAGGATTCGCTGTTACCGGA－3′，下 游 引 物：5′－TCGGCCA GGATGATT CGTCG－3′，扩增基因片段大小301bp。

fyu A：上游引物：5′－ACACGGCTT TAT CCT CTGGC，下游引物：5′－GGCATATTGACG ATTAACGAA，扩增基因片段大小953bp。

1．2．3．3 PCR检测及产物序列测定 按照Fermentas公司PCR试剂盒的使用说明书进行，反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火50 s，72℃延伸90 s，循环扩增30次；72℃延伸5 min。扩增结束后取5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送上海生工生物工程技术有限公司进行基因序列测定。

1．2．4 毒力试验 将检测出的携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因的大肠杆菌H1、H2菌株分别接种无菌肉汤培养基，37℃培养18～24 h，然后取肉汤培养物，分别腹腔注射15～18 g健康小鼠，每只0．5 m L每株菌注射5只，观察小鼠发病情况，对照组同法注射无菌肉汤，观察7 d。

1．2．5 药敏试验 采用 WHO推荐的改良 KB法。

2 结 果

2．1 生化鉴定 生化结果基本一致，其结果为：葡萄糖＋、乳糖＋、蔗糖＋、山梨醇＋、甘露醇＋、靛基质＋、M．R＋、V－P＋、枸橼酸盐－、尿素－、动力＋、硫化氢－、氰化钾－、苯丙氨酸－、赖氨酸＋、氨基酸对照－。2．2 血清型鉴定 挑取优势菌落编号为H1、H2菌株，用大肠杆菌标准单因子血清进行玻板凝集，H1菌株的血清型为O23，H2菌株的血清型为O20。

2．3 分子生物学鉴定

2．3．1 基因组DNA的提取 按照树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明书所述方法进行了大肠杆菌H1和H2菌株基因组DNA的提取，得到了基因组DNA的条带，见图1，表明成功提取大肠杆菌基因组DNA。

2．3．2 毒力基因的PCR扩增 应用特异性引物，以大肠杆菌基H1和H2菌株基因组DNA为模板扩增出了大小约301bp和953 bp的特异性条带，见图2，大小与预期结果基本一致，表明成功扩增并检测到大肠杆菌H1和H2菌株的irp2和fyu A基因。

2．3．3 毒力基因PCR扩增产物序列测定 将扩增大肠杆菌H1和H2菌株irp2和fyu A基因产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序，结果测定出H1和H2株大肠杆菌irp2和fyu A基因序列。

2．3．4 与参考菌株不同血清型大肠杆菌毒力岛同源性比较 用DNAstar生物软件对所测序列和NCBI GenBank中已发表的irp2基因序列比对，结果显示：试验菌株H1和H2菌株O23、O20的irp2基因序列与参考菌株O1、O7、O26、O42及O83的irp2基因序列的同源性在98．5%～99．2%之间，试验菌株H1和H2菌株O23、O20的同源性为99．3%，见图3。按同源性排组原则构成了大肠杆菌的系统进化树：从irp2基因进化树形图上可以看出所列不同血清型大肠杆菌毒力岛irp2基因分为2群，试验菌株H1和H2株O23、O20为Ⅰ群，参考菌株O1、O7、O26、O42及O83为Ⅱ群，见图4。

试验菌株H1和H2株O23、O20的fyu A基因序列与GenBank中的参考菌株O1、O7、O26、O42及O83的同源性在98．9%～100%之间，2个试验菌株H1和H2株O23、O20的同源性98．9%，见图5；从进化树形图上可以看出所列不同血清型大肠杆菌毒力岛fyu A基因分为3群，试验菌株H1株O23与参考菌株O26、O1、O83及O7为Ⅰ群，参考菌株O42为Ⅱ，试验菌株H2株O20为Ш群。试验菌株H2株O20与参考菌株O42株亲缘关系较近，与试验菌株H1株O23株亲缘关系较远，见图6。

图5 fyuA基因序列同源性分析Fig．5 Sequences homologous analysis of fyuA gene from E．coli

图6 fyuA基因核苷酸序列系统发育树Fig．6 The phylogenetic tree of nucleotide sequence of fyuA genes

上述结果根据貉腹泻大肠杆菌irp2、fyu A 2种基因片段同源性分析结果可以看出，貉腹泻大肠杆菌H菌株HPI毒力岛相关基因irp2和fyu A基因片段与GenBank中各参考菌株irp2和fyua基因片段核苷酸序列具有高度的同源保守性，说明HPI毒力岛irp2和fyu A相关基因一般情况下较少发生变异。因此具有HPI毒力岛irp2和fyu A相关基因的大肠杆菌的毒力也很难发生变异，该结果既说明了HPI毒力岛irp2和fyu A相关基因在水貂腹泻大肠杆菌中的存在，也说明了水貂腹泻的发生和死亡与HPI毒力岛irp2和fyu A相关基因有着密切的关系。

2．4 毒力试验 携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyu A大肠杆菌H1和H2的肉汤培养物分别腹腔感染小鼠后，均在24 h左右发病，表现为呼吸急促、食欲不振、双眼半闭、耸毛、运动迟缓等症状，72 h之内相继死亡。解剖死亡的小鼠，发现小肠水肿，肠腔积液等，取腹水、肠内容物培养，仍获原感染菌。对照组观察7 d仍健康如常。

2．5 药敏试验 检测出的2株携带有小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyu A的大肠杆菌对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、头孢唑啉、氯霉素、痢特灵敏感，对氨苄青霉素和红霉素耐药。

3 讨 论

从3个貉场腹泻发病死亡仔貉的脏器及粪便中分离到细菌，经系统生化鉴定，确为大肠杆菌，血清鉴定为O23和O20。我们用PCR方法对其HPI毒力岛进行了检测，检出了HPI毒力岛基因irp2和fyua。且小鼠毒力试验证实是具有毒力的菌株，与临床症状有关。根据流行病学调查其腹泻仔貉的临床表现，其典型的临床症状为食欲不振，精神沉郁，腹泻灰白色粪便，多为粘液便，仔貉多为体温正常或低热，有的仔貉腹泻后死亡，貉场仔貉发病率31%情50%，药敏实验结果表明该菌对诺氟沙星、氧氟沙星、庆大霉素等敏感，临床采用诺氟沙星拌料、对腹泻严重仔貉用庆大霉素灌服病仔貉疗效较好。

毒力岛是外源基因，它借助于可移动性的载体成分进入细菌并插入到染色体上一些特殊的位置（如t RNA位点），赋予宿主菌一些新的毒力特性，也可以通过重组发生缺失，并能在不同的细菌间进行水平传播，它主要含有与细菌毒力有关的一些基因。小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛为45Kb大小，主要的结构基因为irp2和fyu A，该毒力岛赋予了此菌以特殊的毒力，也与该菌的致病性密切相关。毒力岛基因irp2和fyu A是耶尔森菌的主要基因，我们在腹泻仔貉脏器小肠及粪便中检出携带有小肠结肠炎耶尔森菌H PI毒力岛基因irp2和fyu A的大肠杆菌，该类菌对仔貉健康具有潜在性的威胁，应引起重视。

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Detection on pathogenicity islands of Yersinia enterocolitica HPI from Escherichia coli strains in diarrheic young raccoon dogs

ZHANG Yan－ying，SHI Qiu－mei，FANG Hai，CHEN Cui－zhen，LIU Ya－jun，YANG Yue－lin
（Key Laboratory of Hebei Province Preventive Veterinary Medicine，Hebei Normal University of Science ＆ Technology，Changli 066600，China）

To understand the mechanism of E．coli caused diarrhea in young raccoon dogs，HPI pathogenicity islands were detected to carry out Yersinia enterocolitica．Pathogenicity islands gene irp2 and fyu A were detected by PCR amplification，and the virulence of E．coli strains was determined with mice by intraperitoneal injection．E．coli strains were isolatted from organs and feces of diarrhic young raccoon dogs，of which the serotypes were O23 and O20．In pathogenicity islands gene irp2 and fyu A，2 serotypes of E．coli were detected and resulted in the occurrence of serious illness and the death of experimental mice after intraperitoneal injection in virulence detection．Diarrhea in young raccoon dogs infected with E．coli and carrying pathogenicity islands gene irp2 and fyu A of Yersinia enterocolitica HPI，will bring potential threats to the health of young raccoon dogs．

diarrhea；pathogenicity islands gene irp2 and fyu A；Yersinia enterocolitica；young raccoon dogs

R378

A

1002－2694（2012）02－0179－04

＊河北省科技支撑计划（No．08220401D，No．10960408D）和中国博士后基金（No．20100470565）和青岛市科技项目（No．2001A182）联合资助

史秋梅，Email：shiqiumei＠yahoo．com．cn

河北科技师范学院动科院 河北省预防兽医学重点实验

室，昌黎 066600

2011－11－18；

2011－12－05