幽门螺杆菌重组Bb－hpaA－vacA疫苗的构建＊

王国富，高 峰，吴利先

幽门螺杆菌重组Bb－hpaA－vacA疫苗的构建＊

王国富，高 峰，吴利先

目的构建幽门螺杆菌（Hp）重组双歧杆菌（Bb）Bb－hpa A－vac A疫苗。方法通过PCR分别扩增hpa A和vac A抗原编码基因，然后采用基因拼接法（gene SOEing）剪接hpa A和vac A，得到hpa A－vac A融合基因；将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌－双歧杆菌穿梭表达载体pGEX－1λT，构建重组质粒pGEX－hpaA－vac A，电穿孔法将该质粒导入Bb，构建幽门螺杆菌重组hpa A－vac A疫苗，然后用SDS－PAGE和Western blotting鉴定表达的重组蛋白。结果PCR成功扩增出分子量约为1 500 bp的hpaA－vac A融合基因，双酶切证实hpa A－vac A融合基因成功插入pGEX－1λT中，并成功转化入双歧杆菌，而且重组蛋白能在双岐杆菌中得到正确表达，Western blotting显示重组蛋白具有免疫原性。结论成功构建螺杆菌rBbhpa A－vac A疫苗，为该疫苗的进一步研究奠定了基础。

幽门螺杆菌；双歧杆菌；重组hpaA－vac A疫苗；构建

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）能够引起慢性、活动性胃炎和消化性溃疡，同时它也是胃肿瘤的危险因素，并已被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤发生的相关致病菌［1－2］。Hp在我国普通人群的感染率约为50%～80%，并仍以每年1%～2%速度增加［3］。如何根治Hp的感染一直是微生物学和消化疾病领域研究的热点。Hp在胃内定植的关键环节是粘附，是感染的先决条件和致病的关键。Hp粘附素基因hpa A（Helicobacter pylori adhesin A，hpa A）较保守，为Hp所特有，其编码蛋白Hpa A具有粘膜结合特性，并有良好的抗原性和免疫原性［4］。空泡毒素（Vacuolating cytotoxin A，Vac A）可诱导胃上皮细胞发生凋亡，凋亡在Hp致病过程中起着重要作用。而且Vac A在菌株中的表达率与临床发病率非常相符［5］，因此Vac A预防措施显得尤为重要。

双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum，Bb）是一种常见的益生菌，近年来除对双歧菌的益生功能进一步深入研究外，利用该菌作为基因工程受体菌的研究也越来越受重视。与大肠杆菌等宿主相比，双岐杆菌等益生菌作为基因工程受体菌具有特殊的意义，其除能发挥原有的益生功能外，还能发挥佐剂功能。因此构建重组Bb－vac A－hpa A融合基因疫苗具有相当可观的前景。

1 材料与方法

1．1 菌种与质粒 两歧双歧杆菌Bb购自武汉大学菌种保存中心，大肠杆菌－双歧杆菌穿梭表达载体p GEX－1λT由李文桂教授惠赠，质粒p QE－hpa A［6］、p QE－vac A［7］、大肠杆菌BL21由本室保存。

1．2 主要试剂 PCR试剂、高效感受态细胞制备试剂盒（SK9305）购自上海生物工程公司。内切酶、纯化试剂盒和DNA连接试剂盒购自大连宝生物工程公司。NC膜及HRP标记羊抗兔IgG购自北京晨绿生物技术公司。幽门螺杆菌兔抗vac A免疫血清和兔抗hpa A免疫血清由本室制备并保存。

1．3 hpaA－vac A融合基因的扩增 参照 Gene Bank中的hpa A和vac A基因序列设计引物，vac A的上游引物 P1：5′－GCGGATCCATGCATTATTGGGTCAAAG－3′，下游引物P2：5＇－ATGGTACCTTACTATCTTGTTT－3′；hpa A 上 游 引 物 P3：5′－CGGGTACCATGAGAGC AAATAAT－3′，下游引物 P4：5′－CGGTCGACTTCTTATGCGTTATTTG －3′；分别以p QE－vac A和p QE－hpa A 为模板扩增vac A和hpaA基因。再设计引物P5和P6，引入vac A Lingker和hpa A Lingker（IL－3的12个氨基酸的接头）。分别以PCR扩增出的vac A和hpaA基因为模板，P1、P5和P4、P6为引物分别扩增出带Lingker的vac A和hpa A基因。最后再以带Lingker的vac A和hpa A基因的PCR混合物为模板，以P1和P4为引物扩增出hpa A－vac A融合基因（在hpa A与vac A的融合基因之间有IL－3的12个氨基酸的36个碱基接头CAGGAGCAGGACGGGCAGGCGGCTCATGTTTGGATC进行连接）。1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1．4 重组质粒p GEX－hpa A－vac A的构建和鉴定

质粒p GEX－1λT和hpa A－vac A融合基因的PCR产物分别用BHam HI和Eco RI进行双酶切后纯化，将各自纯化后的产物用T4连接试剂盒16℃连接过夜，连接产物转化入BL21感受态细胞。LA培养基筛选后，挑取阳性克隆进行培养，质粒小量抽提试剂盒抽提重组质粒进行PCR和限制性酶切鉴定。鉴定正确后送上海生物工程公司进行测序。

1．5 幽门螺杆菌重组Bb－vac A－hpa A疫苗的构建和鉴定

1．5．1 Bb电转化感受态细胞的制备［8］取生长良好的Bb 1 m L加至100 m L含0．5 mol／L蔗糖的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24～72 h，冰浴2．5 h，期间摇晃悬浮菌体。4℃5 000 r／min离心10 min，弃上清，依次用预冷的10%甘油50 m L、25 m L、10 m L 4℃离心进行洗涤，最后弃上清，加入预冷的10%甘油1．5 m L，充分悬浮菌体，取50μL准备电击转化，剩余感受态细胞－70℃保存。

1．5．2 重组质粒p GEX－hpaA－vac A的电转化 取50μL Bb感受态细菌加至含20μL重组质粒p GEX－hpa A－vac A的Ep管，混匀，冰浴1 min后转移至电穿孔杯中进行电转化。参数设置为：电压为1．5 k V、转化时间为5 ms、转化次数为3次，转化完毕后立刻加入1 m L含0．5 mol／L蔗糖的MRS液体培养基，轻轻移入10 m L培养管中，37℃100 r／min厌氧培养2 h。将培养管中细菌培养液吸至1．5 m L Ep管，3 000 r／min离心5 min，弃大部分上清，将剩余的100μL培养液悬浮，涂于含50μg／m L氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，待吸收后置37℃倒置厌氧培养24～72 h。

1．5．3 重组Bb疫苗的鉴定 挑取上述筛选培养基上单个菌落至100 m L含0．5 mol／L 蔗糖的MRS液体培养基中，加入10μg／μL氨苄青霉素500μL，37℃厌氧培养24～72 h，提取质粒后，PCR扩增hpa A－vac A融合基因及对重组质粒限制性酶切分析鉴定。

1．5．4 p GEX－hpa A－vac A 在双歧杆菌中的表达及Western blot分析 挑取阳性转化菌单菌落接种于100 m L MRS液体培养基中，厌氧培养48h后收获菌体，菌体破壁后进行SDS－PAGE电泳分析表达产物。观察表达条带并用Western blot分析鉴定重组蛋白。具体为将上述SDS－PAGE电泳的凝胶移至硝酸纤维膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2h，PBST震洗3次，分别加入一抗兔抗Vca A血清和兔抗Hpa A抗血清作用2 h，震洗3次，再加入二抗羊抗兔IgG作用2h，震洗后显色。步骤同大肠杆菌。

2 结 果

2．1 hpa A和vac A抗原编码基因以及hpa A－vac A融合基因的扩增 以p QE－vac A和p QE－hpa A为模板，分别以P1、P2和P3、P4为引物扩增vac A（723 bp）和hpa A（783 bp）基因，均在750 bp附近出现了明显条带，大小与预计相符，见图1。通过基因拼接，并以P1和P4为引物扩增出中间带有Lingker的hpaA－vac A融合基因，在1 500 bp左右出现了条带，结果也与预计相符，见图2。

2．2 重组质粒pGEX－hpa A－vac A的鉴定和融合基因的测序 将转化后在LA平板上生长的BL21阳性克隆接种于液体培养基过夜后，提取质粒进行限制性酶切和PCR鉴定，均得到了与预计相符的条带，见图3。鉴定正确后的阳性克隆测序结果与GeneBank中序列相符。说明重组质粒p GEX－vac A－hpa A构建成功。

2．3 rBb－vac A－hpa A疫苗的鉴定 通过电转化Bb后，以从具有AMP抗性的r Bb中提取质粒进行限制性酶切和PCR鉴定。结果与上述图3一致，PCR扩增出了1 500 bp大小的条带，限制性酶切后得到了与PCR大小相符的片段，说明r Bb－vac A－hpa A疫苗构建成功。

2．4 pGEX－hpa A－vac A 在双歧杆菌中的表达和Western blotting分析 重组质粒在双岐杆菌能得到正确表达，但产量不高，约占细菌总蛋白的8．5%见图4。经 Western blotting分析，能分别与兔抗Vca A血清和兔抗HpaA抗血清作用而免疫着色见图5，说明重组融合蛋白兼具有两种单独蛋白的免疫活性。

3 讨 论

Hp与多种胃肠道炎症相关，而且在我国感染率非常高。随着对Hp致病机理及其基因组结构与功能认识的逐步深入，免疫疗法被认为是防治Hp感染最有效最有前景的方法之一。由于双价Hp基因工程疫苗免疫保护效果优于单价疫苗，因此研究多价疫苗及其抗原组合将是Hp疫苗研制的主要方向。

图5 重组蛋白Vac A－HpaA的Western blotting鉴定1，4：蛋白分子量标准；2，5：阴性对照；3：所表达蛋白与兔抗Vac A血清反应的结果；6：所表达蛋白与兔抗Hpa A血清反应的结果Fig．5 Recombinant protein VacA－HpaA identified by Western blot 1，4：Protein marker；2，5：Control；3：Recombinant protein responsed with the anti－Vac A serum；6：Recombinant protein responsed with the anti－Hpa A serum

病原体的特异性粘附由粘附素－受体系统介导，依赖于粘附分子上某些特定的氨基酸位点与受体的结合。有研究证实，Hp粘附素基因hpa A（Helicobacter pylori adhesin A，hpa A）较保守，为Hp所特有，其编码蛋白Hpa A具有粘膜结合特性，并有良好的抗原性和免疫原性［4］。Elisabet等［9］通过构建了Hp的hpa A基因敲除突变株，进一步在小鼠感染模型中证实了Hpa A在Hp定植中的必要性。

1988年，Leunk发现了Hp能使真核细胞空泡变性的毒素，并命名为空泡毒素（Vacuolating cytotoxin A，Vac A）。国内外大量研究证明，Vac A加入多种哺乳动物细胞培养基中，数小时后能够引起细胞空泡样变，3～4d后，细胞变性与死亡。已有研究显示天然的Vac A和重组Vac A均可诱导胃上皮细胞发生凋亡，凋亡在 Hp致病过程中起着重要作用［5］。此外，相较于Hp其他的毒力因子，Vac A在菌株中的表达率与临床发病率非常相符，因此Vac A预防措施显得尤为重要。其中编码蛋白质37k D亚单位的基因片段又相对保守，这就为针对Vac A疫苗的研制提供了有力条件。

双歧杆菌是人和哺乳动物回肠末端及大肠内最主要的生理性菌群，是一种益生菌。重组双歧杆菌疫苗具有下述优点：所表达的靶基因不需纯化，可直接用于免疫接种，免去了蛋白质后处理的复杂工序；单次接种即可诱导机体产生针对靶抗原的免疫反应，而且具有粘膜佐剂的作用；运用分子生物学手段，通过对不同靶抗原的剪切和拼接，可使新型疫苗理想化；双歧杆菌本身作为一种益生菌，对胃粘膜有保护作用，还可提高宿主的免疫力；它价格低廉，适于大量生产，更容易被接受和认可。因此构建vac A－hpa A融合基因疫苗，用双歧杆菌作为载体口服导入机体表达目的基因，诱导机体产生相应抗体，既可阻止Hp的粘附，又可刺激机体产生抗体发挥全身免疫应答。

为了将外源性DNA有效引入双歧杆菌，需要构建大肠杆菌－双歧杆菌穿梭表达载体。本研究所采用的大肠杆菌－双歧杆菌穿梭表达载体p GEX－1λT含有双歧杆菌复制起点、大肠杆菌复制起点、一个多克隆位点和一个氨苄青霉素抗性基因。上游有一个启动子Ptac（trp操纵子启动子与lac操纵子启动子的融合启动子），在IPTG诱导下表达。这种穿梭载体可允许外源性DNA在大肠杆菌中操作，鉴定正确后再转化入双歧杆菌，通过自动复制或同源整合与基因组进行基因交换，从而在双歧杆菌中稳定表达外源性基因［8］。本研究构建大肠杆菌重组质粒p GEX－hpa A－vac A在双歧杆菌中也得到了正确表达，但表达量只有全菌蛋白的8．5%。虽然表达量低，但也表明了双岐杆菌是能够同时发挥其益生菌和表达外源基因的双重作用的。今后研究的重点是对双歧杆菌分子生物学的深入探讨，提高载体的表达能力。

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Construction of recombinant Bb－hpaA－vacA vaccine of Helicobacter pylori

WANG Guo－fu，GAO Feng，WU Li－xian
（Department Microbiology，Basic Medical School，Dali College，Dali 671000，China）

To construct the recombinant Bb－hpa A－vac A vaccine of Helicobacter pylori，hpa A and vac A antigen genes were amplified by PCR and the fusion gene hpa A－vac A was obtained with gene SOEing．Then the fusion gene was cloned into Escherichia coli－Bifidobacteria shuttle plasmid p GEX－1λT to construct p GEX－hpa A－vac A．The recombinant plasmid was electroporated into Bifidobacteria bifidum （Bb）to construct rBb hpa A－vac A vaccine．The recombinant protein was analyzed by SDS－PAGE．Its immunogenicity was identified by Western blotting．A 1500bp fusion gene of hpa A－vac A was successfully amplified by PCR and cloned into pGEX－1λT by restriction analysis，and the rBb hpa A－vac A vaccine was successfully constructed by PCR and restriction analysis．The recombinant protein could be expressed in B．bifidium and it has immunogenicity．In this way，the r Bb hpa A－vac A vaccine of Helicobacter pylori is successfully constructed，which lays the experimental foundation of exploitation and utilization of this vaccine．

Helicobacter pylori；Bifidobacterium bifidum；recombinant hpa A－vac A vaccine；construction

R378

A

1002－2694（2012）02－0131－04

＊云南省自然科学基金（2007C147 M）资助

吴利先，Email：w＿lixian＠163．com；

云南省大理学院基础医学院微生物学教研室，大理671000

2011－06－02；

2011－09－15