影响小儿清热利肺口服液中指标成分转移率的工艺因素研究

冯敬文，卢其福，沈雪梅，龙晓英*，王四元

(1.广东药学院中药学院，广东广州510006;2.广州潘高寿药业股份有限公司，广东广州511400)

小儿清热利肺口服液为广州潘高寿药业股份有限公司的名牌产品，由银翘散和麻杏石甘汤两个古方化裁而成。该产品为金银花、连翘、牛蒡子、麻黄等十一味中药组成的复方制剂［1］，其生产工艺包括水提、醇沉液混合其余分煎药液后浓缩配剂(以下简称浓缩配剂)等流程。鉴于不同批次口服液中活性成分含有量差异较大，因此，探讨活性成分的损失原因以及减少其损失的方法是该产品亟待研究的重要课题。本实验以方中君药与臣药中的活性成分(绿原酸、连翘苷、牛蒡子苷和盐酸麻黄碱)为考察指标，对这些成分在各工艺点的转移率进行跟踪，并对药液中的鞣质与总固形物进行定量分析。

1 仪器、试剂与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪(LC-20A日本岛津);紫外分光光度仪(UV-2450日本岛津);十万分之一电子天平(Satorius BP211D);恒温水浴锅(HH-6宏华新佳)。

1.2 试剂与试药绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110753-200413)，盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号171241-200404)，连翘苷(中国药品生物制品检定所，批号:11084-200711)，牛蒡子苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110819-200404);水质浊度标准物质(中国计量科学研究院);乙腈(色谱纯，迪马公司)，铬皮粉(分析纯，上海迈坤化工公司)，磷酸(分析纯)，甲醇(分析纯)，三乙铵(分析纯)。

小儿清热利肺口服液(广州潘高寿药业股份有限公司，批号:I10001、I05001A、J05001A，以下简称“清利口服液”)。

2 方法与结果

2.1 指标成分测定采用高效液相色谱法测定药液中绿原酸、盐酸麻黄碱、连翘苷与牛蒡子苷［2-4］，具体色谱条件:DiamonsiL TM C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm);体积流量1 mL/min。①检测绿原酸的流动相为乙腈－0.4%磷酸水溶液(10∶90);波长327 nm;柱温30℃。②检测盐酸麻黄碱的流动相乙腈－0.1%磷酸(5∶95，含0.1%三乙胺);波长207 nm;柱温25℃。③检测连翘苷与牛蒡子苷的流动相乙腈－0.02%磷酸溶液(23∶77);波长228 nm;柱温30℃。

2.2 鞣质定量测定-重量法鞣质为水溶性物质，铬皮粉含部分水溶性物质，并可选择性与鞣质结合生成沉淀，分别测定供试药液中的总水溶性部分、不与皮粉结合的水溶性部分和皮粉的水溶性部分，即可求得鞣质质量［5］。精密吸取醇沉上清液5 mL，用蒸馏水稀释至125 mL作为供试溶液进行测定。

2.3 固体物定量测定精密吸取药液10 mL，按《中国药典》2010年版附录XA规定的浸出物测定法测定药液中总固体物含量。

2.4 工艺过程指标成分转移率跟踪实验清利口服液工艺流程主要包括提取、浓缩、醇沉、收醇浓缩、醇沉液混合其余分煎药液后浓缩配剂(以下简称浓缩配剂)、低温冷藏、最终调配封装7个工序。本实验以绿原酸、盐酸麻黄碱、连翘苷及牛蒡子苷4个活性成分转移率为跟踪目标(转移率均以药材中的含量为100%计算)，对两个批次(I05001A、J05001A)产品进行工艺跟踪。实验发现，牛蒡子中也含有绿原酸。因此，口服液中的绿原酸为金银花与牛蒡子中绿原酸的含有量之和。各指标成分于关键工艺工程的转移率结果见图1。

图1数据显示，在提取、醇沉及浓缩配剂工艺过程三步工艺，4种活性成分转移率显著降低，绿原酸、连翘苷与牛蒡子苷的提取率仅为50%左右，同时，在提取工艺中，不同批次的提取率也有差异，因此，本实验对这3个关键工艺的成分转移率开展了进一步实验研究。

2.5 工艺因素对指标成分的影响为进一步了解各工艺因素对4个活性成分转移率的影响，对提取温度与时间、浓缩时间以及醇沉条件等工艺因素对指标成分的转移率进行单因素考察，实验均平行重复三组，取平均值。将大生产中提取所用的温度与时间及浓缩时间(体积)均设计在单因素考察的范围内。

2.5.1 提取温度的影响称取适量药材，加入规定量水，分别于50、60、70、80、90、100℃的条件下单独回流提取1 h，提取液按2.1项方法测定各指标成分，以温度为横坐标，药材的转移率(转移率均以投料总药材中的含有量为100%计算)为纵坐标绘制转移率-温度关系曲线。结果见图2。

图2 温度与各药材的转移率关系(n=3)

2.5.2 提取时间的影响称取药材适量，加入规定量水在100℃条件下单独回流提取，以开始沸腾时为零时刻，分别于20、60、80、100、120 min取样，样品按2.1项方法测定各指标成分，以时间为横坐标，药材的转移率(转移率均以投料总药材中的含有量为100%计算)为纵坐标绘制转移率-时间关系曲线。结果见图3。

图2，图3显示，金银花最佳提取温度为80℃，最佳提取时间约为75 min，牛蒡子中绿原酸量随着温度升高与时间延长而增加，绿原酸在大于60℃时递增幅度加大，在110 min左右变化趋势变缓。麻黄中的盐酸麻黄碱量与温度和时间呈正比的递增关系，提取温度高于70℃时，其含有量随温度显著递增。图2显示，提取温度90℃时连翘苷量最高，继续升高温度，含有量变化不明显;牛蒡子水提液中牛蒡子苷量随温度升高而增加。图3表明，提取时间约60 min药液中连翘苷量高，延长提取时间，连翘苷量递减;牛蒡子的最佳提取时间在100 min左右，之后随时间增加含有量降低。

图3 提取时间与各药材的转移率关系(n=3)

实验结果显示，不同成分有各自的最佳提取温度与时间。总体来看，温度低，提取不完全，温度在100℃内，随温度升高，提取率增加;提取时间延长到一定程度，提取量反而减少。综合考虑，确定最佳提取温度在100℃，提取时间控制在60～75 min内。

2.5.3 浓缩时间的影响为进一步说明长时间的浓缩对指标成分的影响，因此取混合药材提取液3 000 mL于100℃进行浓缩，分别在不同浓缩时间取样(浓缩时间以本制剂水提液浓缩倍数为限度)，另取各指标成分的标准品配制成已知浓度的溶液，保持溶液体积不变情况下浓缩相等时间，样品按2.1项方法测定，以时间为横坐标，转移率(转移率均以初始总溶液中的含有量为100%计算)为纵坐标绘制转移率-温度关系曲线。实验结果见图4。

图4 提取液浓缩时间与各药材的转移率关系(n=3)

图4显示，水提液在浓缩过程中，药液中各指标成分含有量降低并不明显，且这种变化趋势与各对照品溶液在浓缩过程中的变化趋势是相似的。说明各指标成分在浓缩过程中是比较稳定的，浓缩工艺并不是造成活性成分损失的主要原因，在工艺标准下的浓缩体积并不会造成指标成分溶解度降低而析出。

2.5.4 醇沉条件的影响清热利肺口服液的生产工艺中明确规定了醇沉工艺参数包括乙醇体积分数、醇沉次数与放置时间，但是大生产发现，醇沉过程中搅拌方式的不同也可能造成指标成分含有量的差异。因此，本实验对搅拌方式进行考察。

取批次J05001A浓缩液(相对密度为1.171 8)，按生产工艺规定的醇沉浓度、次数及时间在实验室进行醇沉操作，以上清液中各指标成分转移率(转移率以各成分在浓缩液中的含有量为100%计算)，并以鞣质和固形物的去除率为指标评价醇沉效果。将实验室实验结果与大生产样品测得结果进行对比。结果见表1～2。

大生产的醇沉操作为边加乙醇边进行搅拌，待全部乙醇加入后继续搅拌0.5 h，即可静置沉降，静置沉降过程中不再搅拌。实验室醇沉的搅拌方式与大生产略有不同。见表1～2。数据表明，在静置沉降过程中加以搅拌可明显减少各指标成分的损失。

表1 大生产醇沉结果(静置沉降过程中不搅拌)

表2 实验室醇沉结果(n=3)

2.5.5 浓缩配剂工艺的影响此浓缩配剂工艺过程主要是收醇浓缩液混合其它分煎液体后进行浓缩，所得最终浓缩液再与另外分煎液配剂。在此过程中，最终浓缩液因为后续配剂时间的延长而使其出现了大量黑色沉淀物，另外后续配剂只使用最终浓缩液的上层液。

通过对此工艺过程产生的沉淀进行溶解度分析，沉淀溶解于酸液，并且前工艺经过60%醇沉，综合考虑，推测为鞣质。因此对最终浓缩液上层液体和沉淀进行鞣质的测定，结果显示上层液中鞣质质量为38.88 mg/mL、沉淀中的百分比为79.76%。测定新鲜制得与放置2 d后的最终浓缩液中盐酸麻黄碱、连翘苷、牛蒡子苷和绿原酸含量，其转移率(转移率以有效成分在新鲜的最终浓缩液的量为100%计算)分别为81.68%、73.22%、83.37%和83.02%。

3 讨论

本实验针对影响指标成分转移率的三个主要工艺因素的研究表明，提取的工艺条件为100℃、60 min时各指标成分应有较高的转移率，但实际生产跟踪结果可得知各指标成分显著偏低，而且批之间存在差异，这可能与合煎过程中，特别是大生产药材处于静止状态，成分提取不完全、或提取过程中发生成分之间(小分子之间、小分子与大分子之间)的相互作用形成沉淀，或成分吸附于药渣等因素有关。

而醇沉工艺，在明确醇沉浓度，次数及时间的基础上，醇沉过程充分搅拌对指标成分转移率影响较大，因为，醇沉主要去除大分子杂质(蛋白、淀粉、鞣质等)，但大分子杂质在沉淀过程中，如搅拌不匀，将造成局部含醇量过高，淀粉、蛋白质类成分可吸附、包裹部分有效成分共同形成沉淀［6-7］，引起成分损失，但如果沉淀过程中增加搅拌，可使被包裹的有效成分重新分散于醇溶液中，增加有效成分的保留率。因为平衡实验条件下，指标成分绿原酸、连翘苷、牛蒡子苷与盐酸麻黄碱在60%乙醇(工艺醇沉浓度)中的溶解度分别是在水中2.9、5.7、4.5、1.3倍，所以推测醇沉时有效成分被杂质成分吸附包裹而损失。

结合2.5.3项实验结果我们认为，导致浓缩配剂工艺过程中活性成分显著损失的主要原因并不是浓缩工艺。在生产跟踪过程中发现，浓缩配制工艺中的最终浓缩液由于工艺的衔接怠慢，导致静置沉降中会产生大量黑色沉淀，静置时间越长沉淀物越多，上层药液中的活性成分含有量越低。经分析此黑色沉淀主要成分为鞣质。因此，分析成分损失的原因可能与浓缩液里含有的鞣质有关。高浓度的鞣质与活性成分结合或自身聚合包裹活性成分自药液中沉降出来，也是导致成分损失的一个重要原因。

本研究基于对产品的生产过程进行跟踪考察，探讨了小儿清热利肺口服液生产过程中质量的动态变化情况，研究结果对提高复方中药口服液的质量提供了实验依据，具有一定的参考价值。

［1］易明娟，谢子清，谭亿明，等.清热利肺口服液的药理研究［J］.成都中医药大学学报，1997，20(4):35-39.

［2］冯敬文，沈雪梅，王四元，等.小儿清热利肺口服液中盐酸麻黄碱的含量测定方法研究［J］.辽宁中医药大学学报，2011，13(5):102-104.

［3］胡燕，冯敬文，卢其福，等.小儿清热利肺口服液中连翘苷和牛蒡子苷的含量测定方法研究［J］.广东药学院学报，2010，26(5):497-500.

［4］魏大华，冯敬文，王四元，等.小儿清热利肺口服液中总绿原酸的含量测定方法研究［J］.广东药学院学报，2010，26(4):373-376.

［5］时钧，袁权，高从增.膜技术手册［M］.北京:化学工业出版社，2001:137-17.

［6］陈健岳，陈健姿.中药口服液制备工艺中应注意的问题［J］.时珍国医国药，2004，15(5):274.

［7］张兆旺，孙秀梅.中药水提醇沉淀法应用中注意的问题［J］.山东中医学院学报，1995，19(6):421.