多指标综合评分法优选脑通颗粒提取工艺

2012-01-25黄勇张治蓉乔希王爱民况时祥王永林

中成药 2012年1期

黄勇，张治蓉，乔希，王爱民，况时祥，王永林*

(1.贵阳医学院药学院，贵州贵阳550004;2.贵阳中医学院附属第二医院，贵州贵阳550001)

脑通颗粒处方原为贵阳中医学院第二附属医院临床使用的医院制剂方，临床用于心脾气虚，清阳不升，脑络不利，脑髓失养，神机不用，属现代轻度血管性老年痴呆范畴，治疗效果良好。医院制剂内含大量生药原粉，存在质量不易控制、携带不便等缺点，特别是服用剂量过大，导致病人(尤其老年病患者)吞咽不便及胃肠道反应。不利于本品的临床推广应用。

本方由黄芪、水蛭、葛根、西洋参、天麻等药味组成。君药为黄芪，水蛭、葛根为臣，其余为佐使药。根据方义，各药味有其独立而协作的功用，如以单一指标成分进行工艺优选，不能保证本方的整体质量［1-2］。因此，本实验分别以黄芪、葛根、天麻和西洋参中的黄芪甲苷、葛根素、天麻素和人参皂苷Rb1转移率作为考察指标［3-6］，综合评分研究本方的提取工艺，确定本品的最佳工艺参数，为制备质量稳定可控、临床使用安全、有效、方便的剂型提供试验依据。

1 仪器与试药

Prominenece HPLC液相色谱仪系统(日本岛津);Alltech ELSD 800蒸发光检测器(美国奥泰科技公司);WYB-5000型全自动空气泵(北京怡丰瑞普科技有限公司)等。药材均购于贵阳市药材市场，经贵阳医学院生药教研室鉴定合格且均符合2010版中国药典要求。黄芪甲苷(批号:110781-200613)、人参皂苷Rb1(批号:110704-200921)、天麻素(批号:110807-200205)、葛根素(批号:110752-200912)对照品均购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 定量测定

2.1.1 黄芪甲苷和人参皂苷Rb1的测定［7］

2.1.1.1 色谱条件Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱(0 min，25%A;15 min，30%A;35 min，35%A;40 min，80%A;42 min，25%A);柱温为40℃，蒸发光散射检测器(ELSD)，漂移管温度40℃;雾化空气压力0.30 Mpa;进样量10 μL。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不得低于10 000。

2.1.1.2 标准曲线的绘制精密称取黄芪甲苷、人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇配置成质量浓度分别为2.352、2.35 mg/mL的贮备液。分别精密吸取上述两种对照品贮备液0.25、0.5、1、2、4 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱，以峰面积Y的常用对数对进样浓度X的常用对数进行线性回归，得黄芪甲苷、人参皂苷Rb1线性回归方程分别为Y=1.346X+6.965(r=0.998 9)、Y=1.628X+6.756(r=0.999 1)，线性范围分别为0.058 8～0.940 8 mg/L、0.058 78～0.940 0 mg/mL。

2.1.1.3 供试品溶液的制备及测定精密吸取1至16号样提取液适量，置蒸发皿中蒸至近干，残渣加氨试液30 mL使溶解，用水饱和正丁醇提取4次，每次25 mL，合并正丁醇层，用正丁醇饱和的水50 mL提取，分取正丁醇层，至蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，滤过即得。精密吸取各供试品溶液，按上述方法测定。

2.1.2 葛根素和天麻素的测定［7］

2.1.2.1 色谱条件Synergi 4u Hydro-RP 80 A色谱柱(4.6 mm×150 mm，4 μm Phenomenex公司);乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)为流动相，梯度洗脱(0 min，3%A;3 min，5%A;5 min，11%A;20 min，14%A;22 min，100%A;27 min，3%A);温度为40℃;检测波长为220 nm;体积流量为1 mL/min;进样量10 μL。

2.1.2.2 线性考察分别精密称取天麻素、葛根素对照品适量，加50%甲醇配置成质量浓度为0.855 2、2.436 mg/mL的贮备液。分别精密吸取上述两种对照品贮备液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱。以峰面积(Y)对进样质量浓度(X)为进行线性回归，得天麻素、葛根素线性回归方程分别为Y=1.325×107X+3.132×103(r=0.999 7)，Y=2.026×107X-5.021×104(r=0.999 4)，线性范围分别为0.004 276～0.273 6 mg/mL、0.012 18～0.779 5 mg/mL。

2.1.2.3 供试品溶液的制备及测定精密量取1至16号各提取液适量，加50%的甲醇定容至刻度，滤过即得。精密吸取各供试品溶液，按上述方法测定。

2.2 总固体物收得率的测定精密量取各个正交试验号的提取液25 mL，浓缩至干，于105℃干燥至恒质量后于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量。

2.3 提取工艺优选根据该处方中各药味主要药效成分的性质特点［8-10］，结合预实验结果，对乙醇体积分数(A)、乙醇/水用量(B)、提取次数(C)、提取时间(D)4个主要影响因素进行考察。按L16(45)正交表进行试验，每个因素设定4个水平，以黄芪甲苷、葛根素、天麻素、人参皂苷Rb1转移率和总固体得率为考察指标，确定其最佳提取工艺参数。因素水平见表1。

按处方比例称取(1/4)处方量药材，按L16(45)正交试验设计表的条件进行试验。5个指标的权重系数均为0.2［11-13］。试验结果及分析见表2～4。

表1 因素水平表

表2 正交试验表

表3 方差分析表

方差分析结果表明(见表3)，乙醇体积分数(A)、乙醇/水用量(B)对实验结果影响极显著(P＜0.001)，提取次数(C)、提取时间(D)对实验结果的影响显著(P＜0.05)，各影响因素由大到小排列是A＞B＞D＞C，其最佳工艺条件为A4B4C4D1。综合方差分析与一致性子集(见表4)的分析结果，同时考虑大生产合理、节能降耗的要求，确定最佳工艺组合为A3B2C3D3条件。即方中药材除水蛭外以8倍量75%乙醇回流提取2次，每次1 h;药渣与水蛭加10倍量水煎煮2次，每次1 h。

表4 一致性子集表

2.4 验证试验根据正交试验优选的工艺条件，按脑通颗粒处方量称取药材，进行3批验证试验，得黄芪甲苷、葛根素、天麻素、人参皂苷Rb1转移率和总固体得率的平均值分别为81.44%、91.03%、81.21%、65.05%和30.24%，RSD值分别为2.25%、1.53%、0.90%、2.36%和2.62%。表明醇水双提提取工艺稳定、合理可行，可作为脑通颗粒的提取工艺。

3 讨论

本实验在前期确定提取溶媒和提取方法研究中，以药效学试验结合化学指标成分的转移情况为指标考察了溶媒的使用。实验结果表明，本方以水为主要溶媒，基本能将各药味主要有效物质群提取出来，而乙醇效果略差，主要药效物质既有水溶性部位、也有醇溶性部位。化学成分测定结果表明，水、醇单独使用对方中各药味化学成分的提取效率不及醇水双提法，两种溶剂同时使用增加了提取物质群的极性跨度。同时运用LC-MS对不同提取方法提取的样品的指纹图谱进行了研究，结果表明在试验条件下，不同提取方法提取样品指纹图谱的峰形、峰数、峰高存在客观差异，在一定程度反映了样品中物质的转移情况，处方以醇水双提指纹图谱的色谱峰较丰富，峰强度较大，表明样品中物质的转移较为充分。相关研究将在后续文献中报道。

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［2］马志国，代龙.首乌愈瘫片提取工艺的研究［J］.中成药，2009，31(9):1447-1449.

［3］温燕梅.黄芪的化学成分研究进展［J］.中成药，2006，28(6):879.

［4］张东华，董强波，彭曙光.葛根的化学成分、药理作用和临床应用研究［J］.首都医药研究，2007，14(6):44-45.

［5］郝小燕，谭宁华，周俊.黔产天麻的化学成分［J］.云南植物研究，2000，22(1):81-84.

［6］王蕾，王英平，许世泉，等.西洋参化学成分及药理活性研究进展［J］.特产研究，2007，29(3):73-77.

［7］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:54-55，77-78，122-123，312-313.

［8］郭美华，张新建，杨丽杰，等.天麻有效成分的提取工艺研究［J］.中国药物与临床，2010，10(2):175-176.

［9］阎向东，侯志飞，袁骢冲，等.天冰调督胶囊提取工艺研究［J］.时珍国医国药，2010，21(8):1950-1952.

［10］马立新，黄燕，余琰，等.二至胶囊提取工艺研究［J］.甘肃中医学院学报，2010，27(4):62-66.

［11］陈吉航，黄松，黄孟秋，等.多指标综合评分法优选妇科栓剂的提取工艺［J］.中成药，2010，32(3):508-511.

［12］付克，张坤，闫广利.多成分评价优化柴芩清肝方提取工艺研究［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(7):10-12.