鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

高金军 聂文军 张玲琴 赵朝美

（南京市浦口区兽医站，南京 211800）

鸭疫里默氏杆菌病（RA）是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种接触性、败血性传染病，又称鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病等。主要侵害雏鸭、雏鹅及雏火鸡等多种禽类，多发于2～7周龄的雏鸭和雏鹅。10周龄时仍能呈现感染发病，种鸭及成年蛋鸡不易感。潜伏期的长短与菌株的毒力、感染途径以及应激等因素有关，一般为1～3 d，有时长达1周左右。本病可经呼吸道、消化道、刺破的足部皮肤的伤口、蚊子叮咬等多种途径传播{1}。具有较高传染性，发病率在10%～60%之间，死亡率可达30%～90%以上[2]。病程可分为最急性、急性、亚急性和慢性。常见症状为精神沉郁、流眼泪和流鼻液、轻度咳嗽和打喷嚏、排绿色稀粪、共济失调、头颈震颤和昏迷。其特征性病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎。到目前为止，美国、英国、西班牙等均有此病报道。我国郭玉璞等于1982年在北京首次发现此病以来，在全国许多省区相继有此病发生的报道。对浦口地区的可疑病例进行了分离与鉴定及药敏试验，以期为鸭疫里默氏杆菌病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

病料来源于南京浦口地区某鸭场。患鸭临床表现：嗜睡、缩颈、腿软不愿走动或行动蹒跚，共济失调，精神不振，食欲减少或不食，眼和鼻孔有浆液或黏液分泌物流出，排出黄色或黄绿色稀粪。部分病鸭临死前出现痉挛、角弓反张等神经症状。少数病例转圈或倒退，共济失调，病鸭逐渐消瘦、死亡。选择具有典型纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎的病死鸭，无菌操作采集病死鸭的脑、心包液、脾及肝等组织器官。

1.1.2 培养基

普通营养琼脂、麦康凯琼脂，均为杭州天和微生物试剂有限公司产品。普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板按常规方法制作。

1.1.3 主要仪器

电热恒温培养箱，型号：DRP-9082，上海森信实验仪器有限公司生产；

高压灭菌锅，型号：LDZX-30KBS，上海申安医疗仪器械厂生产；

架盘天平，型号：JPT-5，江苏常熟衡器厂生产；

洁净工作台，型号：SW-CJ，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司生产；

显微镜，型号：XSP-2C，上海精密科学仪器有限公司生产。

1.1.4 生化反应试管

葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、硝酸盐还原、硫化氢、甲基红试验、枸橼酸盐微量生化发酵试管，均为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.5 药敏纸片

头孢哌酮、头孢唑啉、氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星、红霉素、氨苄西林、利复平、复方新诺明、磷霉素、新霉素、恩诺沙星、亚胺培南、强力霉素等15种药物为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.6 实验动物

实验用雏鸭，购自非疫区养鸭户的15日龄未免疫雏鸭，常规饲养观察3 d，未发现任何异常后，供动物回归试验使用。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

营养琼脂培养基制备：营养琼脂37 g，蒸馏水1 L，加热溶解后，121℃灭菌15 min；麦康凯琼脂培养基制备：麦康凯琼脂55 g，蒸馏水1 L，加热溶解后，121℃灭菌15 min；鲜血琼脂培养基制备：将灭菌的普通琼脂培养基加热溶解，待冷却至50℃左右，加入无菌的脱纤绵羊或家兔鲜血5%（既每项100 ml普通琼脂加入鲜血5～6 ml）混合后，倾注于灭菌平皿（如果琼脂温度过高，鲜血加入后则成紫褐色，温度过低，则鲜血加入琼脂易凝不易混合。注意，混合时切勿产生气泡）。待凝固后置37℃培养24 h，无菌检验合格方可应用[3]。

1.2.2 细菌的分离与纯化

无菌采取病死鸭的脑、心包液、脾及肝组织，接种于普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板上，置37℃烛缸中培养24 h，观察细菌生长情况，挑取可疑菌落进行涂片染色镜检，同时在普通琼脂平板、麦康凯平板培养基上划线培养，置37℃温箱中观察是否生长，然后再挑取单个可疑菌落接种于鲜血琼脂平板作进一步纯化后保存鉴定[4]。

1.2.3 细菌的形态观察

挑取平板上的单一疑似菌落，按常规方法进行革兰氏染色，镜检。

1.2.4 生化鉴定

从分离出的8株菌的纯培养物中挑取单个典型菌落，分别做葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、硝酸盐还原、硫化氢、甲基红试验、枸橼酸盐和靛基质试验，置于37℃恒温箱培养，观察结果。

1.2.5 药敏试验

对8株菌进行药敏试验，采用药敏纸片法，按常规方法进行。将所分离出的8株菌分别各均匀划线接种在血液琼脂平板上，置37℃烛缸中培养24 h～48 h，观察结果。判断标准：抑菌圈直径大于22 mm为高敏药物，直径18～22 mm者为中敏药物，直径18 mm以下者为低敏药物，无抑菌圈的为不敏感药物。

1.2.6 动物回归试验

随机从8株细菌中选取5株细菌进行。首先将感染菌株菌株接种于血液琼脂平板上，置37℃恒温培养48 h，刮取平板上所有菌落混于灭菌生理盐水中制成细菌悬液，以平板培养活菌计数法确定活菌数量为3×108/ml～4×108/ml，每只18日龄健康肉鸭腿部皮下接种菌液0.5 ml，每株细菌感染4只18日龄健康雏鸭，同时设立灭菌生理盐水注射对照组。接种后每日观察记录鸭的精神、食欲、饮水、粪便、运动及死亡情况，并对死亡鸭进行病理剖检，并取死亡鸭的心血、肝组织按1.2.2方法进行细菌分离培养。

2 结果

2.1 细菌分离

从临床剖检表现为典型纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎的病死鸭中，将脑、心包液、脾及肝等组织均接种于普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板上，置37℃烛缸中培养24 h后，血液琼脂平板上生长了圆形、光滑、湿润、微隆起、半透明露珠状，边缘整齐，无色素的光滑型菌落，直径约1～2 mm，无溶血现象。在普通琼脂平板和麦康凯琼脂平板上未见细菌生长。在不含CO2的普通恒温培养箱内在普通培养基和麦康凯培养基上均不能生长[5]。将以典型病鸭分离到的8株细菌命名为RA1～RA8。

2.2 细菌的染色镜检

将RA1～RA8株细菌革兰氏染色，均为阴性，油镜下观察为小杆菌，少数为椭圆型，无芽孢，多呈单个散在排列，偶见成双或短链状排列。美兰染色可见菌体两极浓染。

2.3 生化鉴定结果

RA1、RA2、RA3、RA4、RA5、RA6、RA7和RA8菌株均不发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇等糖类，硝酸盐还原、甲基红试验、枸橼酸盐试验和靛基质试验均为阴性，不产生硫化氢[6]。这些生化特性与鸭疫里默氏杆菌相似。

2.4 药敏试验结果

RA1、RA2、RA3、RA4、RA5、RA6、RA7和RA8对头孢唑啉、头孢哌酮、亚氨培南、新霉素均高度敏感，大部分菌株对氧氟沙星（RA3、RA5除外）、庆大霉素（RA6、RA7除外）、利福平（RA6除外）、磷霉素（RA2、RA4除外）、恩诺水利星（RA1、RA5除外）、强力霉素（RA2、RA3除外）中度敏感，大部分菌株对四环丙沙星、阿米卡星、红霉素、氨苄西林、复方新诺明不敏感。

2.5 动物回归试验结果

实验组小鸭在接种细菌后，24～120 h内全部发病死亡，5株细菌引起发病和死亡情况基本相同。病死前症状为，精神沉郁、缩颈、不能站立、停止采食和饮水、眼鼻有分泌物、眼眶周围湿润、黄绿色水样腹泻。皮下注射部位发炎，有大量淡黄色较浓稠的渗出物，接种细菌3 d内死亡鸭剖检心包、肝脏、气囊表面的纤维素性渗出不明显，只见肝脏肿大淤血，接种细菌3 d后死亡病鸭剖检心包、肝脏表面、气囊有大量灰白色纤维素性渗出物，部分鸭心包膜与胸内壁粘连，脾肿大。取病死鸭的脑，心血和肝组织涂片检查，可见两极浓染的小杆菌，单个或成对存在。心血和肝组织在血液琼脂平板上划线培养后分离到细菌，染色镜检，生化特性与接种菌一致。对照组未见任何临床症状和病理变化，脑、心血及肝接种血液琼脂平板培养后均无细菌生长。

3 分析与讨论

（1）从临床剖检表现为典型纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎的病死鸭中，以无菌操作将脑、心包液、脾及肝组织划线接种于普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、血液琼脂平板，置于37℃烛缸中培养24 h，分离到8株细菌，采用了细菌培养特性、细菌形态、生化试验等综合方法进行，初步确定分离菌株为鸭疫里默氏杆菌，定为RA1～RA8菌株。从形态学来看，瑞氏染色镜检呈两极浓染，这是多杀性巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌的共同特征，可以和大肠杆菌相区别；从培养特性来看，鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌都能在血液琼脂上生长，但鸭疫里默氏杆菌不能在麦康凯琼脂上生长，而大肠杆菌能在麦康凯琼脂上长出粉红色菌落；通过生化试验，可以和多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌相区别，因为后两者均能发酵糖，而鸭疫里默氏杆菌不能发酵糖[7]。

（2）因为RA血清型众多，相互之间缺乏交叉免疫保护，鉴于鸭疫里默氏杆菌对许多抗生素敏感，长期以来，药物防治一直是生产中控制该病的主要措施。但反复多次投药既增大了养殖成本，且易出现耐药菌株，给该病的防治带来了极大的困难，本试验选用了15种抗菌药物对所分离的8株鸭疫里默氏杆菌进行了药敏试验，为该地区临床用药提供了一定的参考。药敏试验结果表明，该地区鸭疫里默氏杆菌耐药现象比较严重，对大多数菌株敏感有效的药物有头孢类药物头孢哌酮、头孢唑啉、亚胺培南、新霉素四种，氧氟沙星、庆大霉素、利福平、磷霉素、恩诺沙星、强力霉素对大多数菌株中度敏感或不敏感，而环丙沙星、阿米卡星、红霉素、氨苄西林、复方新诺明对菌株不敏感。从经济上考虑，头孢类药物昂贵，使用后会增加养殖成本，该地区目前可选用庆大霉素、恩诺沙星、强力霉素等药物进行防治。尽管如此，不同地区对不同抗菌药的敏感性是不一样的，这也提示临床应用抗菌药防治该病时，必须结合药敏试验结果选择高敏药物或配合用药才能起到预期的效果。不同抗菌药的敏感差异性，可能与不同地区的血清型不同或不同地区用药习惯不同产生抗药性有关[8]。

（3）本病的诊断必须注意和大肠杆菌相区别，两者在临床症状和剖检病变上虽然难以区别，但在细菌的培养特性上却大不相同，大肠杆菌在普通琼脂平板上短期培养即长出茂盛菌落，在麦康凯琼脂平板上生长较好，能使较多的生化试验起阳性反应。鸭疫里默氏杆菌在普通琼脂上几乎不生长，在麦康凯琼脂上不生长，大部分糖、醇发酵试验阴性[9]。在临床诊断工作中，当病鸭病变特征为典型纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎时，兽医人员常误诊为单纯的大肠杆菌感染，而且因条件所限也常常只进行大肠杆菌的细菌分离鉴定和药敏试验，如果用药4～5 d后病情仍得不到有效控制时，就必须考虑鸭群中有传染性浆膜炎感染的存在，此时不能乱用药，以免加重病情。鸭群发病初期同时进行两种病原菌的分离鉴定和药敏试验，然后根据药敏结果选用合适的敏感药物进行5～10 d连续综合治疗，才能获得比较理想的治疗效果。

（4）鸭疫里默氏杆菌对生长条件要求较高，普通培养和保存不可靠，且到目前为止，对本菌保存条件和方法的分流研究较缺乏，这给本病的研究和实际生产带来不便。在本次实验中发现鸭疫里默氏杆菌在厌氧培养中生长较旺盛，有氧条件下亦可生长，但长势较差。在厌氧培养时可以先让蜡烛在缸中燃烧几分钟，烛缸盖暂不盖严，保持半通气状态，几分钟后再盖紧，让蜡烛烧尽，这样可以使缸内CO2浓度增加，提高菌落长出率[10]。吕殿红将带菌鸭血抗凝于-20℃冰箱中保存，鸭疫里默氏杆菌的活力可保持17个月以上，但认为不利纯化保存，易发生污染。实验室保存菌种常用的是继代保存，经常是选用对被保存细菌最适宜的培养基。按常规法接种培养保存，可随时复苏，以供需要，简易便行，但较费时。由于此法保存的时间不长需要不断的继代，增加了菌种受污染的机会。

（5）要重视免疫接种和药物预防相结合。近几年来我国养鸭业发展较快，鸭病也越来越多，再加上大量使用抗生素，使很多细菌、病毒产生了抗药性，发病后治疗效果不理想。因此，必须坚持“预防为主，防重于治”的方针，雏鸭8日龄皮下注射鸭疫里默氏杆菌灭活苗1 ml，第3周龄再加强免疫一次，或4日龄皮下注射鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌二联灭活菌。此外，做好消毒隔离工作，降低饲养密度，减少应激（如冷天鸭群避免淋雨）和外伤也会减少本病发生的机会[11]。

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[7] 濯新国，孟志敏.鸭疫里默氏杆菌的分离、鉴定及防治研究[J].邯郸农业高等专科学校学报，2000.17（2）：4-6

[8] 张大丙，郭玉璞.不同血清型鸭疫里氏杆菌分离株的部分特性比较[J].中国兽医杂志，1999，（10）：13-15

[9] 庄祥弟，王美娟，施明军，等.鸭传染性浆膜炎防治药物的筛选和应用[J].上海畜牧兽医通讯，2002，（6）：19

[10] 邓治邦，朱深海，杨丽君，等.鸭传染性浆膜炎实验性感染方法的研究[J].中国预防兽医学报，2000，22（5）：343-344

[11] 洪冰，王志河，王洪芳.蛋鸭传染性浆膜炎的诊治[J].水禽世界，2006，（3）：34-35