针刺结合抗痫灵对癫痫大鼠海马GABAA R的影响

孙 丽，冯铁为，李敬孝

(1.大庆龙南医院齐齐哈尔医学院附属第五医院，黑龙江大庆163453;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040;3.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

癫痫是大脑神经元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病，发生机制迄今尚未完全阐明。抗癫痫西药有明显的毒副作用等局限性。近年有研究表明，中医药及针灸有缓效、作用时间长、毒性反应和副作用少的优势，本实验通过针药结合观察对戊四氮(PTZ)致癫痫大鼠癫痫发作强度的影响，以及癫痫海马区的GABAAR的表达变化。为中医药治疗癫痫提供进一步的科学依据。

1 材料和方法

1.1 动物分组

实验动物采用4～6周健康雄性Wistar大鼠50只，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。体重180～220 g，随机分成5组。空白组6只，癫痫模型组、抗痫灵处理组、针刺结合抗痫灵处理组、丙戊酸钠(VPA)处理组各11只。

1.2 癫痫动物模型及给药方法

每日固定时间予除空白组以外其余大鼠进行腹腔注射戊四氮(PTZ，购于Sigma公司)造模，PTZ用生理盐水配成2 mg/ml溶液，剂量以亚致痉量35.0 mg/kg为标准。癫痫模型组和空白组大鼠均予以相应剂量生理盐水灌胃，抗痫灵组、VPA组分别给予相应药物灌胃，其中抗痫灵为导师李敬孝临床常用治疗癫痫的有效方剂，药物组成为穿山甲、乳香、没药、龙骨、珍珠、胆南星、石菖蒲。针刺结合抗痫灵组每日定时灌胃给药1次，按照动物穴位定位［1］，针刺百会穴快速进针，留针30 min，运动区［2］，取双侧采取横刺快速进针，在30 min内捻针3次，每次1 min，频率为200转/min以上，30 min以后出针。隔日1次。各实验组大鼠给予相应灌胃6周时间。实验期间各组均以普通饲料及自由饮水。灌服药物的剂量按正常成人(70 Kg)与大鼠给药剂量系数0.018折算：临床丙戊酸钠用量一般为20～30 mg/kg，取其中间值25 mg/kg的剂量，折算成大鼠的灌胃剂量为15.75 mg/kg。

1.3 癫痫发作行为观察

观察每只大鼠出现癫痫发作的潜伏期、持续时间、癫痫发作的强度，每只大鼠ipPTZ后观察2 h。大鼠癫痫发作评分标准［2］：0级：无行为上的发作反应;Ⅰ级：节律性点头或头面部抽动;Ⅱ级：阵挛性咀嚼或点头甩尾;Ⅲ级：头部颤搐加前肢阵挛性抽搐;Ⅳ级：袋鼠姿势或多肢抽动;Ⅴ级：全面性持续强直-阵挛发作。造模大鼠连续出现5天Ⅱ级以上癫痫发作者，证明造模成功。在大鼠造模成功后，停止PTZ腹腔注射。

1.4 Western blot方法检测大鼠海马中的GABAAR相对表达

经过蛋白提取后，确定蛋白质的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，取待测样品与6×样品缓冲液按1：5混匀后于沸水浴中煮沸5 min，置室温冷却。转膜印迹在避光条件下，加入碱性磷酸酶的特异性底物溶液，直至出现清晰的特异性条带。立即将膜浸入去离子水中，漂洗几分钟。经图像分析系统进行光密度扫描分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般状态观察

在实验进行期间，模型组死亡1只，抗痫灵组死亡2只。到实验结束时各组大鼠为：空白组6只、模型组10只、VPA组11只、抗痫灵组9只、针刺结合抗痫灵组11只。在治疗结束后，各组大鼠体重、手色与空白组相比，无明显差异。

2.2 行为观察

在腹腔注射戊四氮7天后，各组大鼠均有出现癫痫发作，呈Ⅱ、Ⅲ级发作为主要表现，个别发作达V级。在造模进入第4周后，癫痫发作平均持续时间又有明显的延长，表明大部分大鼠已造模成功。见表1。

表1 戊四氮诱导41只大鼠癫痫发作行为观察(s)

表1 戊四氮诱导41只大鼠癫痫发作行为观察(s)

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从实验中观察到大鼠Ⅳ～Ⅴ级发作时的潜伏期和持续时间明显比在Ⅰ～Ⅲ级发作时的潜伏期和持续时间长。在Ⅳ～Ⅴ级发作时潜伏期均在2～10 min之间，持续时间在0.5～3 min之间，在Ⅰ～Ⅲ级发作时的潜伏期均在2～30 min之间，持续时间在15～60 min。

2.3 大鼠海马中的GABAAR蛋白相对表达比较

表2 各组大鼠脑组织中海马GABAAR蛋白表达比较(s)

表2 各组大鼠脑组织中海马GABAAR蛋白表达比较(s)

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表2示：模型组大鼠海马中GABAAR蛋白阳性表达显著降低，与空白组比较具有显著性差异(P＜0.01);VPA组、抗痫灵组、针刺结合抗痫灵组的GABAAR蛋白阳性表达较模型组增加，差异性显著(P ＜0.05)。

3 讨论

癫痫在中医学中称为“痫症”，俗称“羊癫风”。中医学理论有对癫痫的病因病机的明确阐述，既有先天禀赋不足引起，也有后天失养或产伤、颅脑外伤、情志失调病因，导致心、肝、脾诸脏受损，产生风、火、癖、痰病理产物使气血逆乱，风火相煽，走窜经络，痰凝气滞，蒙闭清窍，引起癫痫发作，以风、火、痰为主，多属实证;病久不愈，反复发作，正气损伤，由实转虚，多为虚中夹实之证。正气虚，风痰气滞，病邪深入，病情反复难愈，治疗亦较困难。抗痫灵冲剂由穿山甲、乳香、没药、龙骨、珍珠、胆南星、石菖蒲组成。通过用药配伍有豁痰、化瘀、开窍、镇惊、安神、熄风功效，针对癫痫的病因病机症状治疗。笔者曾先期做过系列抗痫灵的实验研究，结果显示：抗痫灵可有效的对抗戊四氮致癫痫大鼠癫痫发作强度，显著降低氨基丁酸转氨酚合成前体谷氨酸(GLu)受体n一甲基天冬氨酸受体(NMDA)的活性，从而可治疗和控制癫痫发作。现代医学研究表明癫痫的发病机制复杂，是脑内抑制性神经递质Y-氨基丁酸(GABA)与兴奋性神经递质谷氨酸和/或天门冬氨酸(Glu/ASp)作用失衡，破坏中枢神经元突触传递所至。γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统最具有代表性的抑制性神经递质，在神经元兴奋性的改变，异常放电的过程中起着非常重要的作用。GABA可以通过作用于GABAAR而抑制Glu的释放［3］，抑制癫痫发作。本次研究结果显示，抗痫灵能明显增强戊四氮诱导癫痫大鼠脑内海马中GABAAR表达，与模型组比较差别有统计学意义。戊四氮致痫模型是一种理想的全身强直-阵挛发作动物模型，针灸可抑制癫痫放电，改善异常脑电图，起到抗癫痫发作的功效。针刺治疗增高脑内GABA蛋白含量［4］，增强细胞免疫功能，提高癫痫患者的免疫球蛋白，降低乙酞胆碱(Ach)含量，调整脑内阿片物质释放，增加脑内单胺类物质，这些都对临床针刺治疗癫痫获得很好疗效提供了重要的科学依据。实验结果显示针刺结合抗痫灵治疗对中枢神经系统具有较强的抑制作用，能减少大鼠的自由活动数，拮抗戊四氮所致大鼠惊厥，抑制大鼠电惊厥的发生率，不失为治疗癫痫的好方法。

［1］ 李忠仁.实验针灸学［M］.北京：人民卫生出版社，2004

［2］ 郭有昌，关国英.中国针灸治疗事典［M］.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1992：227

［3］ Martina EV，Uta R，Peter M，et al.Penty enetetra zole(PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampus of kinedled rats in suppressed by concomitant treatment with Naoxone［J］.Brain Res，1998，792(3)：299-308

［4］ Seyed M，Mirsattari.EEG Monitoring during Funetional MRI in Animal Models［J］.Epilepsia，2007，48(S4)：37-46