葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量测定及酿造工艺对其含量的影响*

于英，李记明，沈志毅，姜文广

(张裕集团有限公司技术中心，山东烟台，264001)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，简称为EC)存在于多数发酵食品中［1－2］。它具有致癌性，世界卫生组织对软饮料中EC制定了限量标准，我国在酒精饮料和发酵食品中尚未制定限量标准。随着人民生活水平的提高，我国酒饮料的消费量日趋上升，尤其是葡萄酒、黄酒、啤酒等营养丰富的含酒精饮料更是人们消费的热点，因此制定酒精饮料中氨基甲酸乙酯限量标准势在必行。

葡萄酒中的EC主要是由尿素和乙醇反应形成的，其次由氨甲酰磷酸和瓜氨酸与乙醇反应生成［3－5］。尿素和乙醇生成EC的反应式如下:

H2NCONH2+C2H5OH→H2NCO2C3H5+NH3

在葡萄酒酿造中影响尿素含量的因素很多。一是在葡萄生长过程中，添加氮源会使发酵的葡萄酒中尿素含量增加;二是酵母发酵过程中，加入尿素作为氮源;三是在酵母菌株本身内部代谢由精氨酸分解产生尿素［6－7］。影响EC生成量的因素除尿素和乙醇浓度外，还有酵母和乳酸菌菌株的种类、葡萄汁中α-氨基酸态氮的含量、发酵及贮藏温度等，其中发酵和贮存温度对EC的形成影响最大，加热可以加快EC的形成［8－10］。在葡萄酒的贮藏过程中，仍存在乙醇和尿素形成EC的反应，但此阶段形成的EC的速度较慢［11］。

本文研究的主要目的是分析葡萄酒酿造工艺条件对氨基甲酸乙酯生成的影响，以建立降低氨基甲酸乙酯生成量的酿造工艺条件;对我国不同类型的干红和干白葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量情况进行调研，为我国葡萄酒安全标准中氨基甲酸乙酯限量指标提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

酿酒葡萄原料:蛇龙珠(Cabernet Gernischt)，采摘于张裕公司葡萄基地。

葡萄酒样品:77款(或批次)干红葡萄酒和17款干白葡萄酒从市场采购。

酿酒酵母:Y1和Y2购于上海杰兔工贸有限公司。

果胶酶:果胶酶P1购于上海杰兔工贸有限公司;P2、P3和P4均购于法国诺盟集团。

乳酸菌:MLB1、MLB2和MLB3均购于上海杰兔工贸有限公司。

药品:乙醚、正己烷、甲醇购自上海国药集团(分析纯)，乙醇购自Sigma公司。

试剂标准品:氨基甲酸乙酯(EC)(纯度 ＞99%)、内标物氨基甲酸丙酯(PC)(纯度＞98%)均购自美国Sigma公司。

1.2 实验仪器

气相色谱Varian GC-3800气相色谱仪，配有氢火焰离子化检测器(美国Varian公司);DC-12氮吹仪，上海安谱公司;Cleanert Silica固相萃取柱，北京艾杰尔科技有限公司。

1.3 实验设计

1.3.1 工艺路线

葡萄原料→除梗破碎(添加30 mg/L SO2)→酒精发酵(25～28℃)→分离→压榨→苹果酸－乳酸发酵→分离→下胶→稳定性处理→过滤→装瓶

1.3.2 设计方案

本研究分A、B、C、D 4个试验组，18个处理。

(A)酵母研究:分4个处理进行，A1添加酵母Y1(250 mg/L)、A2添加酵母 Y1(400 mg/L)、A3添加酵母Y2(250 mg/L)、A4添加酵母Y2(400 mg/L)，添加果胶酶P1(25 mg/L)，不进行苹果酸乳酸发酵，参照工艺路线酿造。

(B)酒精发酵温度研究:分3个处理进行，添加果胶酶 P1(25 mg/L)和酵母 Y1(250 mg/L)，B1、B2、B3分别在30、25、15℃温度下发酵，不进行苹乳发酵，参照工艺路线酿造。

(C)果胶酶研究:分7个处理进行，添加酵母Y2(250 mg/L)，C1、C2、C3 和 C4 在酒精发酵前分别加入果胶酶 P1、P2、P3和 P4(按推荐用量);C5、C6和C7在酒精发酵结束分汁后，分别添加果胶酶P2、P3和P4(按推荐用量)，不进行苹果酸乳酸发酵，参照工艺路线酿造。

(D)乳酸菌研究:分4个处理进行，添加酵母Y1(250 mg/L)，酒精发酵结束后分离，D2、D3、D4 分别加入乳酸菌MLB1、MLB2和MLB3(按推荐用量)，D1自然苹乳发酵作为对照，进行苹果酸-乳酸发酵，参照工艺路线酿造。

1.4 氨基甲酸乙酯的测定

1.4.1 样品处理

取5.0 mL乙醇加到Cleanert Silica固相萃取柱上，活化萃取柱，然后取5.0mL酒样，加到萃取柱上，静止使之吸附10min，先用10mL正己烷淋洗除杂，然后用10 mL乙醚将氨基甲酸乙酯洗脱收集，将洗脱液通过氮吹仪浓缩，最后用无水乙醇定容至0.5 mL，振荡混匀，过0.45μm微孔滤膜，待分析。

1.4.2 色谱条件

色谱柱为SUPELCOWAXTM-10石英毛细管柱(60 m ×0.32 mm ×1.0 μm)，进样口温度 200℃，检测温度210℃，柱温程序:初温50℃，保持1 min，然后以10℃/min升至150℃，再以3℃/min升至220℃，保持5 min;载气流速1.0 mL/min，不分流进样，进样量2.0 μL。

1.4.3 标准品曲线的建立

分别取10.0 mg EC和氨基甲酸丙酯于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中备用;标准使用液:取1 000 mg/L储备溶液，用乙醇稀释使用。

将不同浓度的EC标准溶液从低浓度到高浓度加入内标依次进样，对应于内标物作标准曲线。

1.4.4 样品检测

将处理好的试样，加入内标进样分析，根据保留时间确定峰的位置，并根据峰面积，利用标准曲线计算出试样中EC的含量。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒中EC定性分析

本研究葡萄酒样中EC的鉴定主要通过与标准品的保留时间相比来完成，如图1和图2所示，图1为EC和内标物氨基甲酸丙酯标准品的色谱图，图2为蛇龙珠葡萄酒中EC和内标物氨基甲酸丙酯的色谱图。

图1 EC标准色谱图

图2 葡萄酒样品氨基甲酸乙酯色谱图

2.2 酵母菌对EC生成量的影响

酿酒酵母代谢精氨酸以及尿素的分泌具有菌株特异性，酿造过程葡萄汁中精氨酸可在酵母菌内代谢产生过量的尿素，酵母菌将其从胞内释放到发酵液中，导致葡萄酒中尿素含量升高，过量的尿素和乙醇反应生成EC［6－7］。本文研究了酿造过程中酵母Y1和Y2对氨基甲酸乙酯产生的影响。具体结果如表1所示，所研究的2种酵母菌生成EC含量存在一定差异。在接种量250 mg/L条件下，酵母Y1的EC生成量比酵母Y2少38.8%;而在接种量400 mg/L情况下，酵母Y1的EC生成量比酵母Y2多26.5%。增加接种量，2种酵母的EC生成量表现不同，酵母Y1的EC生成量增加，而酵母Y2降低，这可能与酵母代谢精氨酸以及分泌尿素的能力差异有关。

表1 不同酵母菌的EC生成量 μg/L

2.3 发酵温度对EC生成量的影响

在表2中列出了葡萄酒在30℃、25℃、15℃进行酒精发酵EC的生成情况。可看出:随着发酵温度升高，EC生成量呈增加趋势。这主要由于温度升高，由尿素产生EC的速度会增加，从而使EC的生成量增加［11］。因此降低酒精发酵温度可以减少葡萄酒中EC的含量。

表2 不同发酵温度下EC的生成量

2.4 果胶酶对EC生成量的影响

本研究比较了4种果胶酶及其添加时间对葡萄酒中EC生成的影响，具体结果如表3所示。酿造过程中使用不同果胶酶对葡萄酒中EC的含量有影响，C4中EC含量最高(21.5μg/L);C2中EC含量最低，仅为7.4μg/L，其次是 C1(10.3μg/L)，也相对较低。酒精发酵结束分离皮渣后添加果胶酶的酒样中EC含量比发酵前添加均有所增加，样品C5比C2中EC含量增加了141.9%，C6比C3增加了51.4%，C7比C4增加了1.9%。

表3 不同果胶酶的EC生成量

目前有关果胶酶的使用对葡萄酒中EC含量影响研究尚未见报道，葡萄酒酿造过程中使用果胶酶可以促进果胶的水解，浸提更多酚类物质，增加葡萄浆的澄清度，可调节葡萄发酵醪中蛋白物质含量(如单宁和蛋白聚合、胶体蛋白的沉淀等)。本研究发现酒精发酵过程中商业果胶酶的使用不会增加葡萄酒中EC的含量，与不添加果胶酶发酵相比较，添加果胶酶发酵葡萄酒中EC含量会低一些。

2.5 乳酸菌对EC生成量的影响

葡萄酒苹－乳发酵阶段乳酸菌通过精氨酸脱亚氨基酶途径代谢生成瓜氨酸，该物质为EC的前体物之一［12］。本研究比较了添加乳酸菌进行苹果酸－乳酸发酵对EC生成的影响，结果如表4所示。添加不同的乳酸菌进行苹果酸乳酸发酵后，EC的生成量均有所增加。与D1自然苹乳发酵相比，对照D2添加乳酸菌MLB1的葡萄酒中EC生成量增加了5.6%;D3添加乳酸菌MLB1增加了10.3%;D4添加乳酸菌MLB1产生EC量最大，增加了140.2%。

表4 不同乳酸菌对EC生成量的影响

2.6 国产葡萄酒中的EC含量调查

本研究对国内不同类型的77款(或批次)干红葡萄酒和17款干白葡萄酒中EC含量状况进行了调查。表5中研究结果显示:干红葡萄酒中EC含量分布在7.00～26.80 μg/L范围内，平均浓度为17.90 μg/L。干白葡萄酒中EC含量分布在6.40～21.58 μg/L围内，平均浓度为11.35 μg/L，明显低于干红葡萄酒，这由于干白葡萄酒一般不进行苹乳发酵。葡萄酒中EC含量的差异主要与葡萄原料、产地、酿造工艺等不同有关。

表5 葡萄酒中EC的含量

3 讨论

EC是一种主要产生于发酵食品和饮料中的致癌物质。近年来，各国食品安全部门有关EC的报道不断出现，并纷纷出台相关限量标准。目前，我国还没有对包括葡萄酒在内的发酵饮料和食品中EC含量进行限定的标准和法规。本研究通过对国内不同类型的77款(或批次)干红葡萄酒和17款干白葡萄酒中EC含量的测定，发现干红葡萄酒中EC含量范围在7.00～26.80 μg/L，干白葡萄酒中EC含量范围在6.40～21.58 μg/L，提出葡萄酒安全标准限量指标建议:氨基甲酸乙酯限量范围为≤30 μg/L。

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