新疆传统发酵酸乳中屎肠球菌Enterococcus Faecom的高密度培养

胡敏，闫辉，杨洁

（新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐830046）

新疆传统发酵酸乳中屎肠球菌Enterococcus Faecom的高密度培养

胡敏，闫辉，杨洁

（新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐830046）

对本实验室分离的屎肠球菌（以下编号HT-f）进行高密度培养条件及培养基的优化。研究了该菌生长繁殖的环境条件和培养基组成对其生长的影响。优化后确定了该菌最适生长条件。该菌在培养条件优化前最高生物量为6.83 g/L，而条件优化后的生物量值达到16.6 g/L。对该菌高密度发酵培养基进行了优化，经正交实验处理，得出最佳培养基配方。结合优化的培养条件，最后测得的生物量值则高达35.4 g/L。该研究旨在为后期的工业化生产优质高效的乳酸菌发酵剂奠定基础。

HT-f乳酸菌；高密度发酵；生长曲线；正交实验

0 引 言

乳酸菌广泛存在于发酵乳制品中，大量优良的乳酸菌有待开发和利用[1]。本实验室利用从25个酸乳及奶酪样品中筛选出79株乳酸菌，优选了一株发酵特性好，ACE抑制率较高（52.9%），降胆固醇能力较强（48.9%）的乳酸菌，经分子生物学鉴定为屎肠球菌（以下编号为HT-f），而屎肠球菌是肠系菌群平衡的关键菌株[2]，具有较好的抑菌效果和降胆固醇等益生功能。

高密度培养[3]没有确切的定义，指应用一定的培养技术和装置提高特定产物的比生产率[4]。国外对乳酸菌细胞循环法和透析法做了很多研究[5]。高密度培养技术应用较少[6]，高密度培养条件中，培养基与产量系数和比生长速率之间存在直接关系，高浓度的培养基成分对高密度培养也有一定的抑制作用[7]。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

菌种（HT-f）本实验室筛选自新疆和田地区的酸乳样品。

MRS培养基，PY培养基参考文献[8]中的方法，PYG培养基（在PY培养基中加入0.1%的葡萄糖即可）。

盐 溶 液： 无水CaCl2为0.02%，MgSO4·7H2O为0.048%,KH2PO4为0.1%,K2HPO4为0.1%,NaHCO3为1%,NaCl为0.2%（均为质量分数）。

1.2 仪器与设备

GXZ型智能光照培养箱，Spectrumlab 24可见分光光度计，SHPH-6型 pH控制-补料摇床 （多模式补料），洁净工作台。

1.3 方法

1.3.1 HT-f菌生长曲线、产酸曲线的测定

将实验室保藏菌种活化、纯化、扩培，进行生理生化特性的测定[7]，在两个pH-控制补料摇床专用的500 mL三角瓶中，分别装入200 mLMRS液体培养基，其中一个接入5%的乳酸菌，另一个作为空白对照，37℃培养30 h，每2 h测OD600值。以培养时间为横坐标，OD600值、pH值为纵坐标，绘制生物量变化曲线，产酸曲线[9]。

HT-f菌株发酵OD值与生物量关系：分别取10 mLMRS液体培养基于30支试管中，接入5%的HT-f菌株37℃培养24 h，每2 h测其OD600值、离心测定其沉淀质量即生物量，并以OD600值为纵坐标，生物量为横坐标作图。

由图1可知，在OD600值为0.2～0.8期间，生物量与OD600值呈现线性关系：

式中：Y为为OD600值；X为为生物量值。

1.3.2 培养条件的优化

（1）pH值对HT-f菌高密度发酵的影响。在500 mL三角瓶中分别装入200 mL初始pH值为5.6，5.9，6.2，6.5的MRS液体培养基，接种5%的HT-f乳酸菌菌株，于pH-控制补料摇床37℃发酵120 r/min培养24 h，每4 h测其OD600值，由此确定最佳pH值。

（2）温度对HT-f菌高密度发酵的影响。在500 mL三角瓶中，分别装入体积200 mL的MRS液体培养基，以5%的接种量接种后分别于25，28，31，34，37，40 ℃中培养24 h，每4 h测其OD600值，以此确定最佳发酵温度[10]。

（3）灌装量HT-f菌高密度发酵的影响[11]。 在500 mL三角瓶中分别取30%，40%，50%，60%，70%的灌装量加入MRS液体培养基 （即加入MRS液体培养基150，200，250，300，350 mL），以5%的接种量接种，在最佳温度、最佳pH值进行发酵。用质量分数10%为Na2CO3溶液调节初始pH值来保持发酵期间pH值的稳定。每4 h测其OD600值，以此确定最佳灌装量。

（4）接种量对HT-f菌高密度发酵的影响。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌装量的MRS液体培养基于，分别以3%，4%，5%，6%，7%的接种量接种，最佳温度、最佳pH值为初始值，进行发酵，用质量分数10%的Na2CO3溶液调节初始pH值保持发酵期间pH值的稳定。每4h测其OD600值，以确定最佳接种量。

（5）最优培养环境培养生长曲线、产酸曲线的测定。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌装量的MRS液体培养基，接种后于最佳温度、pH值条件下培养发酵，用质量分数10%的Na2CO3溶液调节初始pH值来保持发酵期间pH值的稳定，每2 h测定OD600值，以培养时间为横坐标，相应的OD600值、pH值为纵坐标，绘制生长量变化曲线，产酸曲线。

1.3.3 培养基的优化[12]

（1）培养基碳源对HT-f菌高密度培养的影响。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌装量的不含碳源的MRS液体培养基。分别加入质量分数2%的不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖）于瓶中。以最佳接种量接种，在最佳温度、pH值条件下培养，用质量分数10%的Na2CO3溶液调节初始pH值来保持发酵期间pH值的稳定，16 h后测定OD600值，以确定最佳碳源。

（2）培养基氮源对HT-f菌高密度培养的影响。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌装量的不含氮源的MRS液体培养基。分别加入1%的不同氮源（如：牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨）。最佳接种量接种，在最佳温度、最佳pH值下培养，用10%Na2CO3溶液调节初始pH值来保持发酵期间pH值的稳定，16 h后测定OD600值，以确定最佳氮源。

（3）培养基生长因子对HT-f菌高密度培养的影响。在500 mL三角瓶中，加入最佳灌装量的液体培养基。分别加入乳清粉、维生素、玉米浆干粉。最佳接种量接种，在最佳温度、最佳pH值条件下培养，用质量分数10%的Na2CO3溶液调节初始pH值来保持发酵期间pH值稳定，16 h后测定OD600值，以确定最佳生长因子。

（4）培养基多因素正交实验。通过以上的单因子试验确定最佳碳源、氮源和生长因子采用正交实验设计确定培养基。确定其因素水平如表1所示。

表1 正交因素水平表

2 结果与分析

2.1 HT-f菌生长曲线、产酸曲线的测定

2.2 培养环境的优化

2.2.1 pH值对HT-f菌株高密度发酵的影响

由图3可以看出，HT-f菌的最优pH值为6.2。在发酵15 h时的生物量达到最大值。做对比得出图3（c）(pH值为6.2)菌体浓度最高，所以HT-f菌的最佳发酵pH值为6.2。从空白对照图3(e)可知，其生物量保持在0.07～0.1之间，说明在本次发酵培养期间没有杂菌污染。

2.2.2 温度对HT-f菌高密度发酵的影响

由图4可以看出，HT-f菌的最优生长温度为34℃。随着发酵时间的延长，上述各温度下所测得的生物量都在逐步增加，其中在34℃下发酵生物量最大，生物量为5.75 g/L。空白对照生物量一直保持在0.07～0.1 g/L之间，则说明本次发酵没有杂菌污染。

2.2.3 灌装量HT-f菌高密度发酵的影响

由图5可以看出，HT-f菌发酵的最佳灌装量为50%。菌株的生物量都随着发酵时间的延长而增长，其中50%的灌装量在12 h的生物量最高为18 g/L。空白对照的生物量保持在0.06～0.18 g/L之间，则说明没有杂菌污染。

2.2.4 接种量对HT-f菌高密度发酵的影响

由图6可以看出，HT-f菌高密度发酵条件最佳的接种量为4%。生物量随着发酵时间的延长而增加，按4%的接种量接种培养，得到了比按其他百分比接种培养都大的生物量15.85 g/L。空白对照的生物量维持在0.07～0.1 g/L之间，则说明本次发酵没有杂菌污染。

2.2.5 最优培养环境培养生长曲线、产酸曲线的测定

煮瓜子不像炒瓜子那样吃多了会上火。外面卖的煮瓜子会有食品添加剂，那么就自己煮，然而自己煮如何烘干呢？这时候暖气就派上用场了。把葵花子加水、花椒、大料和盐煮熟之后，放暖气片上烘干即可。如果您住的是老式红砖楼，那就更好了，楼里配置的铸铁暖气比一般暖气烧得旺，瓜子更容易脱水，保持脆性。

由图7可以看出，10 h时对数期结束，开始进入稳定期，最高生物量达到15.40 g/L，比优化之前的生物量高出一倍多。由空白对照表知其生物量维持在0.06～0.16 g/L之间，说明本次发酵没有杂菌污染。

2.3 培养基的优化

2.3.1 培养基碳源对HT-f乳酸菌高密度培养的影响由图8可以看出，HT-f菌高密度发酵培养基的最佳碳源为麦芽糖。以麦芽糖做碳源时的生物量最高，葡萄糖、蔗糖其次，乳糖最少。空白对照组生物量相对极少，说明没有杂菌污染。

2.3.2 培养基氮源的优化

由图9可以看出，HT-f菌高密度发酵培养基的最佳氮源为牛肉膏。以牛肉膏做氮源时的生物量最高，蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨次之。空白对照组生物量相对最少，培养基成分中起生长因子作用的酵母浸粉、柠檬酸二胺可以作为氮源利用，因此生物量达到7.74 g/L。

2.3.3 培养基生长因子的优化

由图10可以看出,乳酸菌高密度发酵培养基的最佳生长因子是玉米浆干粉。以玉米浆干粉作生长因子时生物量达到最高，乳清粉次之，维生素C最少。空白对照组生物量相对较少，因为培养基成分中起氮源作用的牛肉膏含有部分生长因子，所以生物量也达到了5.26 g/L。

2.3.4 培养基多因素正交实验结果

采用正交实验设计优化碳源（麦芽糖）、氮源（牛肉膏）、生长因子（玉米浆干粉）用量（分别取1.5%，2%，2.5%），实验结果如表4所示。

由表4可以看出，A(碳源麦芽糖)、C(氮源牛肉膏)、D(生长因子玉米浆干粉)的极差分别为5.266、5.640、4.626，有RC＞RA＞RD，则其影响因素主次为CAD。由图10的趋势图可知，最优方案为A2C2D2，但由于表中没有按A2C2D2的配比，需要做补充实验加以证实。按A2C2D2配方其他条件不变，进行补充实验，最终结果测得生物量为35.54 g/L，说明该配比确实为培养基的最适发酵配比。即最适培养基成分比为麦芽糖2%，牛肉膏2%，玉米浆干粉 2%。

2.4 验证实验

将本研究确定的最佳高密度培养条件和最佳培养基配方结合运用在HT-f菌的高密度培养中，得出高密度培养的结果。

表4 正交实验结果

3 结 论

本研究通过对采自新疆传统发酵酸乳样品中筛选出的乳酸菌。将筛选出的HT-f进行活化、纯化、扩培，通过生理生化实验检测，分子生物学鉴定为屎肠球菌。再进行一般发酵测得生长曲线、产酸曲线，确定该菌乳酸菌在培养发酵过程中产酸程度，得到最高生物量为6.83 g/L。在培养环境的优化过程中，得出HT-f乳酸菌的最适温度为34℃，最适pH值为6.2、最适灌装量为50%、最适接种量为4%。利用实验得出的最优培养条件进行生长曲线和酸度曲线测绘，得出最高生物量16.6 g/L，是之前生物量的2.4倍。在前期高密度培养条件和培养基优化的基础上，通过正交试验，确定出HT-f扩大发酵的培养基最佳C源、N源，生长因子配方为麦芽糖 2%，牛肉膏2%，玉米浆干粉2%（均为质量分数）。最终，利用优化后的最佳培养条件和最佳培养基进行高密度发酵，测得最高生物量为35.54 g/L，是一般发酵的5.2倍，由此达到了高密度培养预期目的，使得今后在将该菌应用于工业化生产具有低成本高产量的优势。

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Optimization of cultural conditions of Enterococcus Faecom on high density culture

HU Min,YAN Hui,YANG Jie
（Xinjiang University，College of Life Science and Technology，Urumqi 830046，China）

In order to optimize the culture mediums and the high-dense cultural condition of the HT-f Lactobacillus in this laboratory,the effects of environmental conditionsand medium composition on HT-f lactobacillus'growth have been studied.Under the condition,the highest biomass of the HT-f lactobacillus strain reached 16.6 g/L while the highest biomass under normal cultural conditions was 6.83 g/L.In addition,the experiment also optimized the high-dense culture mediums.According to the orthogonal experiment,the highest biomass finally got to 35.4 g/L.This research was aimed at laying the foundation for the industrious production of high-qualified Lactobacillus in the advanced stage.

HT-f lactobacillus；high density culture；Growth curve；Orthogonal test

Q939.11+7；Q93-335

A

1001-2230（2012）04-0012-06

2011-12-05

胡敏（1985-），女，硕士，研究方向为乳品微生物。

杨洁