酯型茶黄素酶促降解条件的优化

蔡少华 刘仲华 黄建安 王坤波

（1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

酯型茶黄素酶促降解条件的优化

蔡少华 刘仲华 黄建安 王坤波

（1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

比较单宁酶、脂肪酶、猪胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶、果胶酶和α－淀粉酶对酯型茶黄素（TFDG）的水解效果，并对最佳水解酶的反应条件进行优化。结果表明，单宁酶水解酯型茶黄素的效果最好，其反应最佳条件为反应体系的温度40℃、pH 值5.0、酶浓度2.4mg/mL、最佳反应时间120min。水解后茶黄素中简单茶黄素（TF）的含量从52.51mg/g提高到199.84mg/g。

茶黄素；水解酶；单宁酶

茶黄素（theaflavins，TFs）是红茶加工过程中儿茶素类酶促氧化缩合形成的一类色素，与红茶品质高度相关，红茶中茶黄素的质量分数达0.5%～3%。TFs是一类能溶于乙酸乙酯、具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称［1］。目前已发现并鉴定的茶黄素有25种，其中最主要的4种分别为TF、TF－3－G、TF－3’－G和 TFDG。其中 TF由于化学结构中不含没食子酰基，被称为简单茶黄素，后3种茶黄素的化学结构中含有一个或两个没食子酰基，被称为酯型茶黄素，4种茶黄素的化学结构见图1。

图1 4种主要茶黄素的化学结构Figure 1 The chemical structure of four main theaflavins

现已证实，茶黄素具有较好的抗氧化、降脂、降胆固醇和抗肿瘤作用［2－6］。不同的茶黄素组分其功能活性不同［6－8］，但酯型茶黄素由于结构特点，其在水中的溶解度比简单茶黄素相对较低。红茶饮料，尤其是在以茶黄素为主要原料的功能饮料中，如果酯型茶黄素的比例过高，难溶于水的酯型茶黄素会通过分子间相互作用力聚集形成大量沉淀，不但影响产品外观，而且降低了茶黄素被人体摄入的可能性，进而影响茶黄素功效的有效发挥。为了获得溶解性好的简单茶黄素，本试验将单宁酶、脂肪酶、猪胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶、果胶酶和α－淀粉酶对酯型茶黄素的水解效果进行比较，筛选最佳水解酶，并确定该酶水解酯型茶黄素的最佳反应条件，最终使简单茶黄素的含量得到显著提高，旨在探讨茶黄素酶促水解的可能途径，以期为TF单体的制备、功能饮料、天然化妆品、口服液等茶黄素类保健产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红茶提取物粉末（TF∶TF－3－G∶T－3’－G∶TFDG＝1∶2.37∶0.90∶3.49）：TFs质量分数为31%，长沙飞拓植物制品有限公司；

黑曲霉单宁酶：200U/g，昆明杰辉物技术有限公司；

脂肪酶1：5 000U/g，日本 Meito公司；

脂肪酶2：5×105U/g，深圳绿微康生物工程有限公司；

猪胰脂肪酶：2.5×104U/g，上海伯奥生物科技有限公司；

木瓜蛋白酶：8×105U/g，上海生物化学试剂公司；

胰蛋白酶：2.5×105U/g，中国医药（集团）上海化学试剂公司；

果胶酶：5 000U/g，德国Serva公司；

α－淀粉酶：2 000U/g，德国 Merck公司；

糖化酶：500U/g，无锡酶制剂厂；

乙腈、甲醇：色谱纯，国药集团化学试剂厂；

乙酸乙酯、冰醋酸、无水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4：分析纯，国药集团化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：LC－10ATVP，日本岛津公司；

色谱数据工作站：LC solution，日本岛津公司；

色谱柱：Ecosil C185μm×4.6mm×150mm，日本Lubex公司；

电子天平（0.0001）：4504MP，美国 Mettler－Toledo公司；

超声波清洗器：KQ3200B型，昆明市超声仪器有限公司；

pH 计：DELTA－320，美国 Mettler－Toledo公司；

摇床：SKY－200B，上海苏坤实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 茶黄素溶液的配制 准确称取TFs质量分数为31%的红茶提取物粉末1.000 0g，溶于100mL乙醇中，超纯水定容至1 000mL，配制成0.1%质量浓度的溶液待用，此时TF浓度为52.51mg/g。

1.3.2 茶黄素液相色谱分析方法 色谱柱为Ecosil C185μm×4.6mm×150mm，流动相 A为2%醋酸，流动相B为乙腈－乙酸乙酯（体积比7∶1），梯度洗脱，流动相B在30min内从18%线性梯度变化到30%，流速0.9mL/min；柱温40℃；检测波长280nm；进样量10μL。

1.3.3 酶解试验方法 以未加酶的0.1g/L茶黄素溶液作为对照，分别取适量α－淀粉酶、单宁酶、脂肪酶1、脂肪酶2、猪胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶和果胶酶，加超纯水定容至10mL，得到酶活力均为1 000U的酶溶液。将酶溶液转移至具塞锥形瓶中，分别加入40mL 0.1g/L茶黄素溶液，用磷酸缓冲盐将含单宁酶、果胶酶的溶液pH值调为4.5，其余溶液pH值调为7.0，使其pH值均处于酶活力pH值范围内，置于摇床中，于37℃、120r/min反应24h，进行高效液相色谱分析。

1.3.4 单因素试验设计方案

（1）单宁酶添加量对单宁酶水解酯型茶黄素的影响：以0.1g/L茶黄素溶液为原料，调单宁酶浓度为0.2，0.6，1.0，1.4，1.6，2.0，2.4，3.0，4.0，6.0mg/mL，于37 ℃、120r/min摇床中反应12h，高效液相色谱检测茶黄素各组分的含量。

（2）反应温度对单宁酶水解酯型茶黄素的影响：以0.1g/L茶黄素溶液为原料，取酶浓度2.4mg/mL，在温度分别为 20，25，30，35，40，45，50，55，60 ℃，和120r/min、pH 7.0条件下反应12h，高效液相色谱检测茶黄素各组分的含量。

（3）反应时间对单宁酶水解酯型茶黄素的影响：以0.1g/L茶黄素为原料，单宁酶添加量为2.4mg/mL，温度为40℃，120r/min，pH 7.0的条件下反应，每隔30min取样1次作高效液相色谱分析。

（4）pH值对单宁酶水解酯型茶黄素的影响：以0.1g/L茶黄素溶液为原料，单宁酶添加量2.4mg/mL，温度为40℃，120r/min，pH 分 别为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0的条件下反应2h，利用高效液相色谱检测茶黄素各组分的含量。

2 结果与讨论

2.1 水解酶对酯型茶黄素的水解效果

酶解后4种茶黄素的含量见表1。

表1 水解酶对酯型茶黄素的水解效果Table 1 Effect of different hydrolyticenzymes on estertheaflavins /（mg·g－1）

由表1可知，单宁酶能有效水解酯型茶黄素，其中TFDG的含量明显降低，TF的含量明显提高，其余酶的加入基本不影响4种茶黄素比例的变化，说明它们对酯型茶黄素的降解效果不明显，故以优选出的单宁酶进行下一步试验。从茶黄素的分子结构看，酯型茶黄素的没食子酰基暴露于吡喃环外侧，较为活泼，易于被水解酶切除。α－淀粉酶、脂肪酶、猪胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶和果胶酶均属于水解酶类，且它们均能在酯的合成中起到催化作用，而酯的水解是酯的合成的逆反应，故上述各酶在一定的条件下可能会起到水解酯的作用［9－10］。单宁酶对没食子酸酯具有专一水解性，已广泛应用于酯型儿茶素的水解［11］。

2.2 单宁酶酶解酯型茶黄素最佳反应条件的确定

根据单因素试验的结果，对上述因素作四因素三水平的正交分析，因素水平设置见表2，L9（34）正交试验结果见表3。

表2 正交因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 L9（34）试验设计及结果Table 3 The table of orthogonal experiment of the L9（34）

由表3的极差分析可以看出，各因素对TF含量影响的顺序是A＞C＞D＞B；酶解条件的最佳组合是A2B2C1D2，即pH值5、温度40℃、反应时间2h、酶浓度2.4mg/mL，该组合条件下所得产物TF质量浓度为199.84mg/g，优于单因素试验的结果和正交组合中试验号6的198.37mg/g的最高TF质量浓度。方差分析的结果见表4。由表4可知，pH和反应时间对单宁酶水解茶黄素的影响显著。

表4 正交试验方差分析表Table 4 The table of variance analysis of orthogonal experiment

2.3 单宁酶处理前后茶黄素含量的对比

在40℃、pH＝5、酶浓度2.4mg/mL条件下，将0.1g/L的茶黄素溶液置于摇床中以120r/min反应2h，单宁酶处理前后4种茶黄素含量的对比见表5。由表5可知，所得产品中TF的含量达199.84mg/g，较原有产品有很大的提高。3种酯型茶黄素 TF－3－G、TF－3’－G和 TFDG的水解较为彻底，TFDG被单宁酶切除两个没食子酰基，TF－3－G 和 TF－3’－G被单宁酶切除一个没食子酰基，3种酯型茶黄素的水解后的终产物均为TF和没食子酸。

表5 单宁酶处理前后4种茶黄素含量对比Table 5 The contrast of four theaflavins contents before and after the Tannase treatment /（mg·g－1）

3 结论

（1）单宁酶对酯型茶黄素的水解效果优于其他水解酶，对单宁酶水解酯型茶黄素的反应条件优化后，3种酯型茶黄素已基本转化为TF，利用单宁酶水解技术能够得到TF含量高的茶黄素。相较于常规色谱分离法，整个处理过程只用到少量乙醇，没有其他任何有害溶剂的介入，水解反应时间只需2h，该项技术具有绿色、高效的特点，且TF在水中的溶解度比酯型茶黄素要高，拓宽了茶黄素在食品、化妆品，特别是功能性饮料领域的应用范围。

（2）单宁酶在水解酯型茶黄素的同时，也能水解茶黄素中残存的酯型儿茶素，水解后的儿茶素更容易通过柱层析与茶黄素分离。在高TF含量的茶黄素基础上，通过大孔树脂去除混合物中的儿茶素、没食子酸、咖啡碱、绿原酸等杂质，可以纯化制备TF单体，为TF单体的开发提供了一种简单高效的新思路。

（3）如何利用固定化单宁酶水解酯型茶黄素，从而降低TF的生产成本，以及TF在不同环境条件下的稳定性试验，是该领域下一步的研究热点。

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11 王赞苗，李永刚.单宁酶对酯型儿茶素作用研究［J］.中国食品添加剂，2005（1）：42～44.

Optimization on hydrolysis condition of estertheaflavins by hydrolytic enzymes

CAI Shao－hua LIU Zhong－hua HUANG Jian－anWANG Kun－bo

（1.Key Lab of Tea Science of Ministry of Education，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128，China；2.National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Changsha，Hunan410128，China）

The research was designed by using enzymes including tannase，lipase，porcine pancreatic lipase，papain，trypsin，glucoamylase，pectinase andα－amylase，to compare the hydrolytic effect of estertheaflavins（TFDG）and to obtain the optimum reaction conditions of the best hydrolase was selected.Results showed that the optimum condition were as follows：temperature of reaction system 40℃，pH 5，enzyme concentration 2.4mg/mL，reaction time 120min.The content of TF increased from 52.51mg/g to 199.84mg/g under these optimum conditions.

theaflavins；hydrolase；tannase

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.036

国家自然科学基金（编号：30901161）；科技部国际合作重点项目（编号：2006DFA33220）；国家茶叶产业技术体系项目（编号：2010）

蔡少华（1986－），男，湖南农业大学在读硕士研究生。E－mail：ahua＿cai＠yahoo.com.cn

刘仲华

2011－03－01