RP－HPLC法测定核桃外果皮中齐墩果酸的含量

张瑞廷 徐 佳 傅 力

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

RP－HPLC法测定核桃外果皮中齐墩果酸的含量

张瑞廷 徐 佳 傅 力

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

建立核桃外果皮中齐墩果酸含量测定的反相高效液相色谱法（RP－HPLC），采用色谱柱为Intersil ODS（150mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇∶水∶冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）；流速0.8mL/min；进样量20μL；检测波长为210nm；柱温30℃。结果表明，齐墩果酸进样量在0.728～7.28μg（r＝0.999 7）范围内呈现良好的线性关系，齐墩果酸平均回收率 （n＝9）为101.1%，相对标准偏差（RSD）为2.44%。测得核桃外果皮中齐墩果酸含量为2.1mg/100g。该方法简便快速，结果可靠准确，重现性和稳定性好。

反相高效液相色谱法；核桃外果皮；齐墩果酸

核桃外果皮成分复杂，主要化学成分有胡桃醌、α－氢化胡桃醌－4－葡萄糖苷、鞣质、没食子酸、胡桃醌生物碱及萘醌等。最新报道显示核桃外果皮中存在齐墩果酸［1］，齐墩果酸（oleanolic acid，OA）是五环三萜类化合物，以游离体和配糖体的形式存在于多种植物中，具有保肝护肝、抗炎抗菌抗病毒、抗氧化、抗癌等药理作用［2］，齐墩果酸的分析方法目前尚无国标方法，常用的检测方法有薄层色谱法［3］、气相色谱法［4］、液相色谱法等，其中以液相色谱分析方法居多，对于不同的检测对象，采用液相色谱法检测齐墩果酸的条件均有所不同［5－7］，采用液相色谱法分析核桃外果皮中齐墩果酸尚未见报道。本试验在前人研究［8－10］的基础上，通过对检测条件的优化，建立核桃外果皮中齐墩果酸的液相色谱分析方法。齐墩果酸较易溶于氯仿、甲醇、丙酮、乙醇等，但不溶于水和石油醚。本试验在样品制备过程中，先用乙醇进行提取，再用石油醚萃取出极性较小的成分，最后用氯仿萃取齐墩果酸。通过不同极性溶剂的分级萃取，以保证核桃外果皮中齐墩果酸的提取效果，同时降低在分析过程中其他成分对齐墩果酸的干扰。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

齐墩果酸标准品：美国Sigma公司；

甲醇：色谱纯，美国天地公司；

高效液相色谱仪（配SPD－20A紫外检测器，LC solution色谱工作站）：岛津LC－20AB，日本Shimadzu公司；

紫外可见光分光光度计：TU－1810，北京普析通用仪器有限责任公司；

梅特勒分析天平：XS205，梅特勒－托利多上海有限公司；

循环水式多用真空泵：SHB－Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司；

旋转蒸发器：RE－85C，上海青浦沪西仪器厂；

旋涡混合器：XH－C，常州市国立试验设备研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 齐墩果酸标准储备液配制 称取齐墩果酸标准品9.1mg，用甲醇定容至25mL，摇匀，即得0.396mg/mL的齐墩果酸标准溶液，于4℃保存。

1.2.2 样品溶液制备 将阴干的核桃外果皮粉碎后过40目筛，得到核桃外果皮粗粉。取50g粗粉加入500mL 95%乙醇浸提，过滤后减压浓缩，得到乙醇浸膏2.25g，将乙醇浸膏用适量蒸馏水分散，依次用石油醚、氯仿萃取，减压浓缩各萃取溶液，得到不同萃取部位浸膏。称取氯仿萃取部位浸膏0.016 0g加入1mL甲醇，涡旋振荡使其充分溶解，微孔滤膜（0.45μm）过滤，滤液供进样。

1.2.3 HPLC分析条件 色谱柱为Intersil ODS（150mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇∶水∶冰乙酸 （265∶35∶0.1，V/V）；流速0.8mL/min；检测波长210nm；柱温30℃；进样量20μL。

1.2.4 检测波长的选择 齐墩果酸标准品在紫外可见光分光光度计上进行吸收光谱扫描，扫描波长范围190～600nm，得到几个最大吸收波长。在此基础上利用液相色谱在1.2.5中4种不同的流动相，通过比较几个最大吸收波长范围下的色谱图筛选出最佳波长。

1.2.5 流动相的选择 比较甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）、甲醇－水－三乙胺（85∶15∶0.06，V/V）、乙腈－甲醇－水－乙酸铵（69∶16∶15∶1，V/V）、以及甲醇－0.1mol/L NaH2PO4（85.2∶14.8，V/V）4种流动相条件下核桃外果皮中齐墩果酸的分离效果及峰形对称性。

1.2.6 线性关系考察 吸取齐墩果酸标准品溶液（0.396mg/mL）2，4，8，10，15，20μL，分别进样3次，以色谱峰面积（Y）为纵坐标，标准品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.7 精密度试验 吸取齐墩果酸标准品溶液（0.396mg/mL），进样20μL，连续6次，测定齐墩果酸的含量，计算RSD值。

1.2.8 稳定性试验 取1.2.2制备的样品溶液，分别在0，2，4，6，8h进样20μL测定齐墩果酸含量，计算RSD值。

1.2.9 重复性试验 取 1.2.2制备的样品溶液，进样20μL，重复进样6次，测定齐墩果酸的含量，计算RSD值。

1.2.10 加标回收率试验 在已知齐墩果酸含量的核桃外果皮中分别加入14.56，29.12，58.24μg齐墩果酸标准品，按1.2.2方法制备样品溶液，微孔滤膜（0.45μm）过滤，按1.2.3色谱条件进样20μL测定峰面积，计算加标回收率。

1.2.11 核桃外果皮中齐墩果酸含量测定 称取按1.2.2制备得到的核桃外果皮氯仿萃取部位浸膏0.016 0g，加入1mL甲醇，涡旋使其充分溶解，微孔滤膜（0.45μm）过滤，进样20μL分析，重复测定3次，经外标法定量，计算齐墩果酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 齐墩果酸标准品溶液的紫外吸收扫描

由图1可知，在紫外分光光度计上对齐墩果酸标准品溶液进行扫描，发现在208，209，213，214nm 4个波长处均有吸收峰，见图1。

图1 齐墩果酸标准品吸收光谱图Figure 1 Absorption spectrum of oleanolic acid standard sample

2.2 检测波长的选择

依据齐墩果酸标准品的紫外扫描结果，在1.2.5中4种不同流动相条件下，通过比较208～214nm下的色谱图，发现波长为210nm，流动相为甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.01，V/V）时，基线相对平整，分离效果较好，齐墩果酸峰形对称（见图2），故最终选择210nm为检测波长。

图2 标准品的HPLC色谱图Figure 2 HPLC chromatograms of standard sample

2.3 流动相的选择

当采用乙腈－甲醇－水－乙酸铵（69∶16∶15∶1，V/V）以及甲醇－0.1mol/L NaH2PO4（85.2∶14.8，V/V）为流动相时，齐墩果酸与核桃外果皮中其他成分的色谱峰出现叠加，分离效果不甚理想。当采用甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）和甲醇－水－三乙胺（85∶15∶0.06，V/V）为流动相时齐墩果酸的分离效果较好，且峰形比较对称。加入少量三乙胺虽然有利于改变峰形［11］，提高分离度，但是三乙胺对ODS柱的损害较大。因此选择甲醇－水－冰乙酸（265∶35∶0.1，V/V）为流动相，能够较好的分离齐墩果酸（如图2所示）。同时该流动相的弱酸性环境有利于改变峰形。由于齐墩果酸在酸碱条件下均不稳定，所以冰乙酸的添加量应控制流动相的pH值保持在6.5。

2.4 标准曲线的绘制

齐墩果酸标准品的色谱图见图2，得到回归方程为：Y＝1.087 59×106X＋74 605.9（r＝0.999 7），齐墩果酸进样量在0.728～7.28μg范围内呈现良好的线性关系，齐墩果酸的保留时间约为10min，齐墩果酸和相近的其他峰分离完全（分离度＞1.5）。

2.5 精密度试验

由表1可知，相对标准偏差RSD（n＝6）为1.89%，表明精密度良好，能够满足试验要求。

表1 精密度试验结果Table 1 Result of precision test（n＝6）

2.6 稳定性试验

由表2可知，齐墩果酸在0，2，4，6，8h含量稳定，相对标准偏差（RSD）为2.34%（n＝5）。

表2 稳定性试验结果Table 2 Result of stability test（n＝5）

2.7 重复性试验

由表3可知，相对标准偏差（RSD）为1.96%（n＝6），显示重复性良好。

表3 重复性试验Table 3 Result of repeating test（n＝6）

2.8 加标回收率试验

由表4可知，齐墩果酸平均加标回收率为101.1%，相对标准偏差（RSD）为2.44%（n＝9），表明加标回收率较好。

2.9 核桃外果皮中齐墩果酸含量测定

由图3可知，核桃外果皮中齐墩果酸与其他成分分离较好，且目标峰峰形对称，经外标法定量，计算得出核桃外果皮中齐墩果酸含量为2.1mg/100g。

表4 齐墩果酸加标回收率结果Table 4 Recovery experiment of oleanolic acid（n＝9）

图3 核桃外果皮的HPLC色谱图Figure 3 HPLC chromatograms of walnut pericarp

3 结论

（1）本试验在绘制标准曲线过程中，没有按传统配制一系列浓度的标准品溶液，而是通过改变进样量的体积来改变标准品的浓度，提高了试验的精度，减少了在配制标准品溶液过程中可能出现的误差。

（2）本试验采用反相高效液相色谱法对核桃外果皮氯仿萃取部位中的齐墩果酸进行定性定量分析，检测出齐墩果酸的含量较高，达到了2.11%，因此从核桃外果皮中提取分离齐墩果酸具有实际意义，能够增加核桃外果皮新的利用途径及经济附加值。

1 周媛媛，王栋，牛峰.抗肿瘤中药青龙衣化学成分的研究［J］.中草药，2010，41（1）：11～14.

2 Zhu Y M .Synthesis and anti－HIV activity of oleanolic acid derivatives［J］.Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，2001（11）：3 115～3 118.

3 张建平，包海花，刘海峰，等.薄层色谱法鉴别蛇莓中齐墩果酸［J］.牡丹江医学院学报，2010，31（1）：57～58.

4 闫花丽，赵陆华，朱丹妮，等.衍生化气相色谱法测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］.中国中药杂志，1999，24（12）：744～745.

5 袁晓环，王伟光，李春彦，等.HPLC法检测蛇莓中齐墩果酸的含量［J］.中国生化药物杂志，2010，31（3）：195～197.

6 张兴旺，梅丽娟，邵赟，等.HPLC法测定甘青铁线莲中的齐墩果酸［J］.分析试验室，2009（28）：238～240.

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8 朱春林，杨洪元.亚微肝泰片中齐墩果酸的含量测定［J］.中国中医药信息杂志，2010，17（11）：47～48.

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10 陈亮，甘辉，刘洪.反相高效液相色谱法测定木瓜中齐墩果酸和乌索酸的含量［J］.安徽农业科学，2007，35（32）：10 183～10 184.

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Determination of oleanolic acid in walnut pericarp by RP－HPLC

ZHANG Rui－ting XU JiaFU Li

（College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Xinjiang，Urumqi830052，China）

The method was established for the determination of oleanolic acid in walnut pericarp by RP－HPLC，with the chromatographic column of intersil ODS（150mm×4.6m，5μm），the mobile phase consisted of methanol∶water∶acetic acid（265∶35∶0.1，V/V）at the flow rate of 0.8mL/min；the injection volume was 20μL；the detection wavelength was 210nm and the column temperature was 30℃.The results showed that the good linear range of oleanolic acid was 0.728～7.28μg（r＝0.999 7），and the average recovery（n＝9）rate was 101.1%with RSD of 2.44%.The content of oleanolic acid in walnut pericarp was 2.1mg/100g.This method is simple and quick.The result is accurate and repeatable.

RP－HPLC；walnut pericarp；oleanolic acid

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.023

国家“十一五”科技支撑计划项目（编号：2007BAD36B04）；新疆维吾尔自治区高校科研计划科学研究重点项目（编号：XJEDU2008I13）

张瑞廷（1982－）男，新疆农业大学在读硕士研究生。E－mail：zrt00016203＠sina.com

傅力

2011－03－25