酪蛋白酶解液中β－酪啡肽－7的液相色谱检测

王立晖袁永俊王 芃李培骏

（1.天津现代职业技术学院，天津 300222；2.西华大学，四川 成都 610039；3.温州质量技术监督检测院，浙江 温州 325000）

酪蛋白酶解液中β－酪啡肽－7的液相色谱检测

王立晖1袁永俊2王 芃1李培骏3

（1.天津现代职业技术学院，天津 300222；2.西华大学，四川 成都 610039；3.温州质量技术监督检测院，浙江 温州 325000）

研究活性多肽β－酪啡肽－7的检测。采用高效液相色谱法对胃蛋白酶解样品中活性肽（β－酪啡肽－7）进行测定。结果表明，对比标准品的保留时间发现水解0.5，1.5，2.5h的1，3，5号样品含有β－酪啡肽－7。经过重复进样，结果仍然一致。

液相色谱；β－酪啡肽－7；胃蛋白酶

酪蛋白来源于乳，含有人体必需的8种氨基酸及日常食物中的限制氨基酸赖氨酸、蛋氨酸等，是一种完全蛋白质（PER值为2.5），能够非常好的促进生物体生长发育［1］。牛乳中酪蛋白（casein），约占总蛋白的78.8%，根据氨基酸组成和电泳行为有所不同分为α、β、κ、γ4种结构，其中β－酪蛋白占酪蛋白总量的28.2%。酪蛋白在动物消化道中经蛋白酶分解产生的肽段除了营养功能外其特殊生物学活性已受到广泛重视［2］。

具有特殊生物功能和生理作用的肽总称为生物活性肽，是目前营养学研究的热点，包括酪蛋白经蛋白酶水解后分离得到许多生物活性肽类物质［3］。酪啡肽是来源于β－酪蛋白所以也称β－酪啡肽。试验中胃蛋白酶的水解专一作用主要是针对苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键，对酪蛋白具有较好的水解度［4］。酪蛋白的酶解液中成分复杂，能否简便高效的检测出目标多肽成为研究热点。农业部乳品质量监督检验测试中心赵建国等［5］建立了一种较为便捷的分析方法即高压反相液相色谱来测定乳中的酪蛋白的水解产物C12，获得了一定的效果。南京农业大学张源淑［6］以杂交瘤细胞株法与酪蛋白及其胃蛋白酶酶解消化液共同孵育并利用细胞活性鉴定法证明了酪蛋白经胃蛋白酶处理后有阿片样活性物质释放。上述方法均能对酪蛋白酶解液中的多肽进行检测但是检测程序均比较复杂。本试验参考文献［7］的方法，对于酪蛋白经胃蛋白酶水解的产物是否含有目标肽β－酪啡肽－7进行检测，旨在验证高效液相色谱法能够有效的检测出酪蛋白酶解液中的β－酪啡肽－7。

1 材料与方法

1.1 试验材料

干酪素：生化试剂，北京奥博生物技术责任有限公司；

胃蛋白酶（P－7000）：酶活性1∶10 000，美国Sigma公司；

甲醛：分析纯，成都科龙化工试剂厂；

交联葡聚糖Sephadex G－15：上海博耀生物科技有限公司；

甲醇：色谱纯，天津市博迪化工有限公司；

乙腈：色谱纯，美国Methanol Fisher公司；

β－酪啡肽－7标准品：美联西安生物科技有限公司；

其他试剂：均为分析纯。

1.2 试验仪器

pH计：PHS－25型，上海雷磁仪器厂；

恒温磁力搅拌器：78HW－1型，江苏省金坛市医疗仪器厂；

水浴恒温振荡器：SHA－B型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司

超声波仪：AS5150A型，美国Ultrasonic公司；

高效液相色谱仪：SHIMADZU型，日本岛津公司；

紫外－可见监测器：SPD－10A型，日本岛津公司；

紫外－可见分光光度计：TU－1800PC型，北京普析通用仪器有限公司；

微孔过滤膜：型号（0.45nmφ50），上海市新亚净化器件厂。

1.3 方法

1.3.1 样品制备 在酪蛋白底物浓度为10mg/mL，胃蛋白酶添加量为溶液总量1%，体系pH值为1.6，酶解温度为55℃ 的条件下，分别水解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5h制备7个样品，再于4℃以4 000r/min离心10min，取上清液过滤，滤液于4℃保存备用［8］。将交联葡聚糖凝胶Sephadex G－15用水溶胀后装入1.7cm×57.5cm的分离柱中，使用Tris－HCl缓冲液洗脱平衡，缓冲液用量一般为床体积量2～3倍。然后将制备的样品分别进柱分离。按照优化的层析条件进行分离，并参考分离标准曲线进行目标峰的收集［9］。

1.3.2 样品预处理 收集交联葡聚糖凝胶Sephadex G－15柱分离的目标峰，放入－74℃冰箱冷冻8h，然后放入冷冻干燥机，先打开制冷装置预冷到－54℃，然后把样品依次快速放入干燥机，密封好，开启真空泵，真空冷冻干燥48h，取出样品，记录干重，待色谱检测。

1.3.3 样品检测 根据文献［7］的方法进行检测，对比β－酪啡肽－7标准品检测结果（保留时间29.912s）。使用微孔滤膜过滤和超声波仪对溶剂进行预处理。

2 结果与分析

2.1 酪蛋白水解

由表1可知，随酶解时间的越长，样品水解度逐渐增大。

表1 样品编号及水解度Table 1 Numbers and hydrolysis degree of Sample

2.2 样品检测结果

通过文献［7］建立的高效液相色谱检测方法对于水解样品1～7号进行高效液相色谱检测，结果显示2，4，6，7号样品无明显出峰，而1，3，5号样品有明显出峰，见图1～3和表2。

图1 样品1色谱分析图Figure 1 Sample No.1

图2 样品3色谱分析图Figure 2 Sample No.3

图3 样品5色谱分析图Figure 3 Sample No.5

表2 样品分析结果Table 2 Result of Sample

对比β－酪啡肽－7标准品检测结果保留时间29.912s发现部分样品中含有β－酪啡肽－7，即是水解0.5，1.5，2.5h的1号，3号，5号样品，经过重复进样，结果仍然保持一致。水解1.0，2.0，3.0，3.5h的样品均未检测出β－酪啡肽－7，分析可能是样品中β－酪啡肽－7浓度过低，未达到试验限。β－酪啡肽－7的检测结果，出现了断点，未出现理想中的连续变化，可能有几个原因：① 酶解试验中使用的胃蛋白酶（P－7000）纯度欠佳，可能含有杂质或其他混合酶类，会对胃蛋白的精确切割位点产生影响。② 大量的非目标产物即在不同水解时间生成的不同杂质和多肽，可能会影响到分离与检测。③ 在试验操作中可能有一些人为操作误差或一些未知因素而造成比较大的误差，可能影响了最后的结果。

3 结论

本试验参考文献［7］的高压反相液相色谱分析方法来测定的酪蛋白的水解产物中的β－酪啡肽－7，但是检测的准确度和可重复性还有待提高。使用RP－HPLC法鉴定水解液中多肽是目前国内外最多用的方法，但是由于酶解液中蛋白质片段的种类多且黏度大，很难用一种方法实现高效的分离。采用更有效预处理方法、采用合适的流动相调节剂、采用更高效的分离柱会有效的提高分离效率，有待于下一步研究。

1 张必武，乐国伟，施用晖，等.乳蛋白源阿片肽－β－酪啡肽［J］.饲料研究，2001（6）：13～14.

2 Yu VY.The role of dietary nuclcotides in neonatal and infant nutrition［J］.Singapore Med.J.，1998，39（4）：145～50.

3 张必武，乐国伟，施用晖，等.乳蛋白源阿片肽－β－酪啡肽［J］.饲料研究，2001（6）：13～14.

4 邹思湘.酪蛋白源活性肽［J］.生命的科学，1993，13（1）：18～20.

5 张源淑，邹思湘.乳源阿片肽活性物质对动物消化、代谢的影响［J］.中国饲料，2001（13）：14～15.

6 张源淑，陈伟华，邹思湘.用HPLC测定酪蛋白酶解产物中的β－Casomorphin－7［J］.中国乳品工业，1999，27（1）：37～38.

7 孙勇民.β－酪啡肽－7的高效液相色谱检测［J］.食品工业，2008（3）：49～53.

8 王立晖.胃蛋白酶水解酪蛋白生成β－酪啡肽－7的研究［J］.中国酿造，2010（4）：64～67.

9 白泉，葛小娟，耿信笃，等.反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备［J］.分析化学研究简报，2002，30（9）：1 126～1 129.

Examination ofβ－Casomorphin－7from casein by pepsin

WANG Li－hui1YUAN Yong－Jun2WANG Peng1LI Pei－Jun3

（1.Tianjin Modern Vocation Technology College，Tianjin300222，China；2.Xi Hua University，Chengdu，Sichuan610039，China；3.Wenzhou Instiute of Technology and Calibration，Wenzhou，Zhejiang325000，China）

This paper mainly research on the examination of active polypeptideβ－Casomorphin－7.Using HPLC chromatography on pepsin solution in a sample ofβ－Casomorphin－7detection.Compared with the results of standard retention time found the hydrolysis of 0.5h，1.5h，2.5h，No.1，No.3.No.5samples containing beta casomorphin 7，after repeated sampling，the results remained consistent.

HPLC；β－Casomorphin－7；pepsin

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.035

四川省科技厅应用基础项目（编号：0325127）

王立晖（1981－），男，天津现代职业技术学院讲师，硕士。E－mail：wanglihui2008＠126.com

2011－08－01