Alcalase酶解高底物浓度玉米蛋白工艺优化

宋占兰郑喜群刘晓兰

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

Alcalase酶解高底物浓度玉米蛋白工艺优化

宋占兰1，2郑喜群1，2刘晓兰1，2

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

以玉米蛋白粉为原料，研究底物浓度、加酶量、水解液pH值和水解温度对酶解产物水解度、可溶性蛋白含量、抗氧化活力和蛋白转换率的影响。首先将玉米蛋白粉顺次进行碱洗、α－淀粉酶去淀粉和高温蒸煮预处理，以破坏蛋白高级结构和去除淀粉，然后以碱性蛋白酶Alcalase为生物催化剂进行玉米蛋白（10%～15%，m∶V）的限制性水解。结果表明，最适酶解条件：底物浓度13.5% （m∶V），加酶量2%，水解温度68℃，反应体系pH值7.7，总水解时间210min。在上述条件下，蛋白水解度为28.81%，水解液的可溶性蛋白含量为31.69mg/mL，水解物抗氧化活性为547.83U/mL，蛋白转化率为36.92%。获得的玉米蛋白水解物的溶解性显著增加，具有良好的抗氧化活性，显示了其在食品和药品等行业应用的潜力和前景。

玉米蛋白粉；碱性蛋白酶；水解度；可溶性蛋白；抗氧化活性；蛋白转化率

以玉米为原料采用湿法生产淀粉时，可以分离出玉米干基6%左右的副产物——玉米黄粉（corn gluten meal，CGM；又称玉米蛋白粉）。玉米黄粉中约含62%～71%的蛋白质，其余是20%的淀粉和约13%的纤维素，还含有15种无机盐以及玉米独有的黄色素［1］。玉米黄粉中的蛋白质主要由玉米醇溶蛋白（zein，65%～68%）和谷蛋白（glutelin，22%～23%）组成，还有少量的球蛋白（globulins，1.2%）和白蛋白（albumin）。蛋白质的营养性和功能性均取决于其氨基酸组成和结构。从营养性角度讲，玉米黄粉中的蛋白质不是人类理想的蛋白质，因为玉米黄粉中含人体必须的赖氨酸、色氨酸量少，而疏水性氨基酸量多，造成氨基酸组成不平衡，这种不平衡的氨基酸组成限制了其在食品领域的应用。蛋白质的功能性必须在其具有良好的水溶性的前提下才能充分表现出来，蛋白质功能的改变基本上都是由于其结构的改变造成的，采用改变蛋白结构的加工方法或蛋白酶解技术可以将其功能特性释放出来［2］。改性后的玉米蛋白不仅具有良好的溶解性、流动性、热稳定性，还具有降血压、抗氧化［3］、促酒精代谢等生理活性。本试验针对玉米蛋白的结构特点，采用碱处理、去淀粉和高温蒸煮依次处理玉米黄粉，再结合Alcalace蛋白酶解技术对高底物浓度玉米蛋白酶解规律进行初探。高底物浓度玉米蛋白酶解所需的设备容量小，设备利用率高。本试验旨为玉米蛋白酶法修饰的工业应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米黄粉：黑龙江省青冈县淀粉厂；

Alcalase碱性蛋白酶：酶活为2.7×105U/g，丹麦 NovoNordisk公司；

α－淀粉酶：酶活为2 850U/g，北京奥博星生物技术有限公司；

其他试剂：均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

紫外－可见分光光度计：TU1810，北京普析通用仪器有限责任公司；

贝克曼紫外－可见分光光度计：DU800，贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；

凯氏定氮仪：消化系统K437，蒸馏系统B324，瑞士Buchi公司；

低速离心机：TGL－16G，北京医用离心机厂；

pH计：PB－10，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米黄粉预处理方法

（1）碱处理：用浓度为4%的NaCO3溶液处理玉米黄粉，添加量为16mL/g，在40℃恒温水浴锅中处理10min，去除NaCO3溶液后按固液比1∶15（m∶V）加冷水搅拌洗涤玉米黄粉10min，洗去残留的NaCO3溶液后，溶液于3 000r/min离心20min，去除上清液，沉淀于60℃恒温干燥箱中烘干、研磨、备用［4］。

（2）去淀粉：用pH 6.0的0.02mol/L磷酸盐缓冲液配制成浓度为10%的碱处理后的玉米黄粉溶液，α－淀粉酶加酶量为30U/g，温度40℃，处理2h，反应结束后酶解液在100℃ 灭酶20min，过滤去除淀粉水解产物，残渣再用同量的蒸馏水洗涤3次，以彻底去除淀粉水解的产物。酶解液于3 000r/min离心20min，去除上清液，沉淀于60℃恒温干燥箱中烘干、研磨、备用［5］。

（3）高温蒸煮：将碱处理、去淀粉处理后的玉米黄粉进行高温蒸煮，蒸煮压力为0.1MPa，蒸煮时间为30min，料液比≥1∶2.5（m∶V）。蒸煮后玉米黄粉于60℃恒温干燥箱中烘干、研磨、备用［6］。

1.3.2 碱性蛋白酶Alcalase水解高底物浓度玉米蛋白粉的条件优化 将预处理后的玉米黄粉按一定底物浓度用pH 8.5的50mmol/L的Tris－HCL缓冲液配制成玉米黄粉溶液［3］，加入一定量的Alcalase碱性蛋白酶，在一定的温度和pH条件下，在恒温振荡水浴中进行酶水解反应120min，每隔一定时间用pH－滴定法测定玉米蛋白水解度，并在此相应时间间隔分别取酶解液，酶解液立即于100℃ 沸水中加热20min以钝化酶活力，在3 000r/min离心20min，测定上清液中可溶性蛋白含量和抗氧化活性。

（1）单因素试验：主要考察水解温度、酶解液pH、底物浓度和加酶量对酶催化水解反应的影响。

（2）正交试验：在单因素试验基础上，进行L9（34）正交试验［7］，确定Alcalase碱性蛋白酶催化的最佳水解条件。

（3）确定最佳酶解时间：在最佳水解条件下酶解，确定适宜酶解时间，同时测定最佳酶解条件下酶解物的最终水解度、可溶性蛋白含量、抗氧化活性以及蛋白转化率。

1.4 分析方法

1.4.1 水解度的测定 pH－Stat法［8］。

1.4.2 可溶性蛋白含量的测定 Folin－酚法［9］，以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白。

1.4.3 抗氧化活性的测定 改进的邻苯三酚自氧化法——微量进样法［10］。

1.4.4 可溶性蛋白转化率的测定 取水解、离心后得到的蛋白水解液15mL，加入10%的三氯乙酸（TCA）15mL，混合均匀静置30min，于4 000r/min离心10min，取离心后的上清液10mL消化并进行凯氏定氮，测定可溶性蛋白转化率［11］。

式中：

P——可溶性蛋白转化率，%；

X——酶解液中溶于10%TCA的氮含量，g；

X0——未酶解前溶于10%TCA的氮含量，g；

S0——底物蛋白质的总氮含量，g。

1.4.5 总蛋白质含量的测定 微量凯氏定氮法［12］。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 温度对Alcalase水解玉米蛋白的影响 温度对玉米蛋白的水解有较大的影响［13］。温度对反应速率的影响主要是影响反应速率常数，在较低的温度范围内，反应速率常数随着温度的增加而增加，因而酶反应速率增加。但超过一定温度后，酶发生热失活引起酶的催化速率下降。在底物浓度10% （m∶V）、水解液pH 8.5、加酶量3%的条件下，考察温度分别为55，60，65℃时对Alcalase催化水解反应的影响，结果见图1～3。

由图1～3可知，Alcalase碱性蛋白酶在温度65℃条件下对玉米蛋白粉的水解效果更明显，水解度和可溶性蛋白含量都随着水解时间的延长呈现逐渐增加的趋势，水解120min后，酶解液水解度为24.9%，可溶性蛋白含量为26.36mg/mL，抗氧化活性呈现不规则的变化，但60min后趋于稳定，最终可达到430.05U/mL。

图1 温度对Alcalase水解玉米黄粉水解度的影响Figure 1 Effect of temperature on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

图2 温度对Alcalase水解玉米黄粉可溶性蛋白的影响Figure 2 Effect of temperature on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

图3 温度对Alcalase水解玉米黄粉抗氧化活性的影响Figure 3 Effect of temperature on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

2.1.2 pH对Alcalase水解玉米蛋白的影响 水解液的pH值直接影响酶与底物的结合和催化。玉米蛋白在偏碱的条件下溶解度较高，这是因为在此情况下玉米蛋白发生了解离，部分玉米蛋白内部的亲水性集团暴露出来，从而提高了玉米蛋白的水溶性［14］。在底物浓度10%（m∶V）、水解温度60℃、加酶量3%的条件下，考察水解液pH分别为8.0，8.5，9.0时对 Alcalase催化水解反应的影响，结果见图4～6。

图4 pH对Alcalase水解玉米黄粉水解度的影响Figure 4 Effect of pH on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

图5 pH对Alcalase水解玉米黄粉可溶性蛋白含量的影响Figure 5 Effect of pH on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

图6 pH对Alcalase水解玉米黄粉抗氧化活性的影响Figure 6 Effect of pH on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

由图4～6可知，Alcalase碱性蛋白酶在pH为8.0的条件下对玉米蛋白粉的水解效果更明显，水解度和可溶性蛋白含量都随着水解时间的延长而逐渐增加，最高水解度可达到25.78%，可溶性蛋白含量可达28.47mg/mL，抗氧化活性呈现不规则变化，但最终较高，可达到411.37U/mL。

2.1.3 底物浓度对Alealase水解玉米蛋白的影响 底物浓度与反应速度和产物生成量都有关系。当玉米蛋白底物浓度较小时，酶相对过量，底物不足以结合所有的酶，使得一部分酶未能充分发挥其作用，随着底物浓度的增大，过量的酶与底物充分结合，水解度随底物浓度的增加而增大，当酶完全与底物结合后，这种增加的趋势逐渐减弱。在水解温度60℃、水解液pH 8.5、加酶量3%的条件下，考察底物浓度分别为10%，13%，15%（m∶V）时对Alcalase催化水解反应的影响，结果见图7～9。

由图7～9可知，Alcalase碱性蛋白酶在底物浓度13%（m∶V）条件下对玉米蛋白粉的水解效果更明显，水解度随着水解时间的延长呈现逐渐增加的趋势，最高水解度可达到27.31%，可溶性蛋白含量可达27.16mg/mL，抗氧化活性在前40min呈现逐渐增大的趋势，40min之后趋于稳定，可达到461.54U/mL。

图7 底物浓度对Alcalase水解玉米黄粉水解度的影响Figure 7 Effect of concentration of substrate on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

图8 底物浓度对Alcalase水解玉米黄粉可溶性蛋白含量的影响Figure 8 Effect of concentration of substrate on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

图9 底物浓度对Alcalase水解玉米黄粉抗氧化活性的影响Figure 9 Effect of concentration of substrate on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

2.1.4 加酶量对Alcalase水解玉米黄粉程度的影响 水解反应速度的快慢直接和酶的浓度相关［15］。当加酶量较小时，随着加酶量的增加，参与反应的酶的分子越多，相应的酶解速度就越快。当加酶量较大时，产物积累对酶的竞争性抑制较大，反应速率降低。在底物浓度10%（m∶V）、水解液pH 8.5、水解温度60℃的条件下，考察水解液加酶量分别为1%，2%，3%时对Alcalase催化水解反应的影响，结果见图10～12。

图10 加酶量对Alcalase水解玉米黄粉水解度的影响Figure 10 Effect of rafio of E：S on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

图11 加酶量对Alcalase水解玉米黄粉可溶性蛋白含量的影响Figure 11 Effect of rafio of E：S on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

图12 加酶量对Alcalase水解玉米黄粉抗氧化活性的影响Figure 12 Effect of c rafio of E：S on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

由图10～12可知，当加酶量（E：S）大于2%时，玉米蛋白水解度和可溶性蛋白含量随加酶量的增加其上升的幅度不明显，而且抗氧化活性有下降趋势，再通过增加酶量的方法来提高水解度不会有显著的改善。因此，根据酶成本及生物活性肽的释放，试验范围内的Alcalase碱性蛋白酶酶解最适加酶量为2%，此时酶解液水解度为25.59%，可溶性蛋白含量为24.9mg/mL，抗氧化活性呈现不规则的变化，但90min后逐渐升高，最终可达到411.37U/mL。

2.2 酶解条件的进一步优化

在单因素试验的基础上，采用正交试验方法，进一步优化酶解条件。以玉米黄粉水解度（DH）为指标，对底物浓度（A）、水解温度（B）、加酶量（C）和pH（D）4个因素选用四因素三水平试验表L9（34）以确定Alcalase酶解高底物浓度玉米黄粉的最佳条件，L9（34）正交试验因素水平表见表1，L9（34）正交试验方案及结果见表2，方差分析表见表3。

表1 L9（34）正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交试验方案及结果Table 2 Design and result of orthogonal test of L9（34）

由表2可知，极差分析得出影响Alcalase酶解高底物浓度玉米蛋白酶解物水解度的因素主次顺序为温度（B）＞底物浓度（A）＞加酶量（C）＞pH（D），最佳组合为 A3B3C2D1。由表3对正交试验结果的方差分析表明，底物浓度、温度、加酶量和pH对水解度的影响均具有显著性，当底物浓度为13.5%（m∶V），水解温度为68℃，加酶量为2%，pH 为7.7，酶解时间为120min时，酶解液水解度为26.06%，可溶性蛋白含量为28.40mg/mL，抗氧化活性为338.46U/mL，蛋白转换率为35.27%。

表3 方差分析表†Table 3 Analysis of variance table

2.3 适宜酶解时间的确定

以水解液可溶性蛋白含量和抗氧化活性为检测指标，在底物浓度13.5%，水解温度68℃，加酶量2%，pH值7.7条件下进行酶解，考察适宜的水解时间。结果见图13。

图13 Alcalase玉米黄粉蛋白水解物可溶性蛋白含量和抗氧化活性随水解时间的变化Figure 13 The content of soluble protein and antioxidative activity of hydrolysate by Alcalase during hydrolysis

在最适的温度和pH值条件下，水解物的可溶性蛋白含量随水解反应时间的延长而增加，在开始水解反应的30min内，水解物抗氧化活性的增加趋势与可溶性蛋白含量一致，30min后开始下降，在反应50min时达到最低点，随后抗氧化活性呈不规则变化，在210min时抗氧化活性达到最大值，可溶性蛋白含量也趋于平缓。综合考虑，蛋白酶Alcalase水解玉米黄粉蛋白适宜的时间为210min，此时酶解物水解度为28.81%，可溶性蛋白含量为31.69mg/mL，抗氧化活性为547.83U/mL，蛋白转化率为36.92%。试验结果与低底物浓度（5%）玉米蛋白酶解［2］进行比较可知，酶解物水解度变化不大，但水解物可溶性蛋白含量提高了13.75%，抗氧化活性提高了60.76%。

3 结论

本试验以依次经过碱处理、α－淀粉酶去淀粉、高温蒸煮处理的玉米黄粉为底物，采用Alcalase碱性蛋白酶对其酶解，通过单因素和正交试验确定了Alcalase碱性蛋白酶的最适酶解条件。结果表明：Alcalase碱性蛋白酶水解高底物浓度玉米蛋白的最适酶解条件为底物浓度13.5%（m∶V），水解温度68℃，加酶量2%，水解液pH 7.7，在此条件下水解210min酶解基本结束，此时酶解物水解度为28.81%，可溶性蛋白含量为31.69mg/mL，抗氧化活性为547.83U/mL，蛋白转化率为36.92%。高底物浓度玉米蛋白酶解不但可以提高设备利用率、节约成本，而且能够提高产物的溶解性和抗氧化活性。

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Optimization of hydrolysis condition on high concentration of corn gluten by Alcalase

SONG Zhan－lan1，2ZHENG Xi－qun1，2LIU Xiao－lan1，2

（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar，Heilongjiang161006，China；2.Key Constructive Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province Normal University，Qiqihar，Heilongjiang161006，China）

By using corn gluten meal as raw material，the effects were studied to level of hydrolysis，quantity of dissolve protein，antioxidation ability and ratio of protein conversion from substrate concentration，enzyme addition，hydrolysate pH value，hydrolysis temperature.Firstly，corn gluten meal was conducted through alkali wash，starch removal byα－amylase，and a pretreatment of thermophilic digestion，in order to breakdown higher－order structure of protein and remove starch.Then，Alcalase，which was used as biocatalyst，was to hydrolyze corn gluten meal（10%－15%，m∶V）.The effects of substrate concentration，enzyme addition content，pH，and tempera－ture on degree of hydrolysis，were investigated.The content of soluble protein，antioxidative activity，and the ratio of protein conversion were investigated.The best hydrolysis results was obtained by conducting the hydrolysis at 68 ℃ with substrate concentration 13.5%（m∶V），enzyme addition 2%，pH 7.7and 210min.Under the optimal condition，degree of hydrolysis of corn gluten meal reached 28.81%，the content of soluble protein of hydrolysates was 31.69mg/mL，antioxidative activity was 547.83U/mL，and the ratio of protein conversion reached 36.92%.The solublity of the hydrolysates increased significantly and displayed good antioxidative activity.The results indicated that the hydrolysates had potential and promising application in the filed of food and medicines industry.

corn gluten；alcalase；hydrolyzing degree；soluble protein；antioxidant activity；protein conversion rate

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.061

国家自然科学基金资助项目（编号：31071629）；黑龙江省自然科学基金资助项目（编号：B200919）

宋占兰（1986－），女，齐齐哈尔大学在读硕士研究生。E－mail：libaosheng521＠126.com

郑喜群

2011－08－01