苹果渣液态厌氧发酵制备生物氢气的研究

马晓珂王振斌陈克平王倩倩，王世清

（1.江苏大学生命科学院，江苏 镇江 212013；2.中国江苏大学—美国加州大学生物能源联合研究中心，江苏 镇江 212013；3.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109）

苹果渣液态厌氧发酵制备生物氢气的研究

马晓珂1王振斌2陈克平1王倩倩2，3王世清3

（1.江苏大学生命科学院，江苏 镇江 212013；2.中国江苏大学—美国加州大学生物能源联合研究中心，江苏 镇江 212013；3.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109）

以苹果渣为原料，通过液态厌氧发酵技术制备氢气，经过单因素试验和正交试验研究苹果渣与活性污泥的比例、发酵温度、初始pH、发酵液浓度对苹果渣厌氧发酵产氢效率的影响。结果表明，苹果渣液态厌氧发酵产氢的最优条件：发酵温度为（30±2）℃、活性污泥与苹果渣比率为4∶10、初始pH值8.5、发酵液浓度0.125g/mL，该条件下，苹果渣产氢率达到19.29mL/g·TS。

苹果渣；液态发酵；厌氧发酵；生物氢气

氢气是一种燃烧值高的清洁能源［1，2］。以厌氧发酵的方式制备氢气是一种经济、环境友好的制备方法，具有广阔的应用前景［3，4］。目前以有机废弃物为原料，通过厌氧发酵的方式制备氢气已成为研究开发的热点。

苹果渣是苹果汁加工的下脚料，含有丰富的营养成分，处理不当会造成资源浪费和环境污染［5，6］。果渣的用途主要用作喂养牲畜的饲料，附加值较低。对苹果渣应用的研究也有很多，如生产蛋白饲料、果胶、膳食纤维、柠檬酸、苹果白兰地、果胶低聚糖、食品添加剂、芳香物质、果胶酶、苹果醋等方面。但目前苹果渣产业化处理方法仅限于果胶的提取。从苹果渣中提取果胶需要处理大量的苹果渣才能获得利润，同时为了提高果胶的分离和提取效率，避免果胶被酶解，需要对苹果渣进行干燥处理。因此，理想的苹果渣应用方法仍在探索之中。

苹果渣中含有较多的纤维素和糖类，具有厌氧发酵制备氢气的潜力，且发酵残渣可以作为有机肥料［6，7］。本试验以活性污泥为产氢菌源，以废弃苹果渣为底物，采用液态厌氧发酵方法，考察苹果渣原料与活性污泥的比例、发酵温度、初始pH和发酵液浓度对苹果渣厌氧发酵产氢的影响，以期为苹果渣的综合利用和氢气的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

活性污泥：镇江征润州污水处理厂；

苹果渣：水分含量 11.6%（干基），总固定物（TS）85.8%，挥发性固体（VS）97.6%，陕西海升实业集团乾县分公司；

盐酸、氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

高纯氢气、甲烷、二氧化碳标准气体：南京特种气体厂有限公司。

1.2 试验仪器

分光光度计：WFJ7200型，尤尼柯（上海）仪器有限公司；

气相色谱仪：HP－5890，安捷伦科技公司；

数显恒温水浴锅：HH－S型，金坛市医疗仪器厂；

数字酸度计：PHS－25型，上海理达仪器厂；

高速台式冷冻离心机：TGL－16，湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 活性污泥的预处理 活性污泥采用碱预处理方法，以氢氧化钠调整活性污泥pH为11，煮沸1.5h，然后用盐酸调整至pH 6.5，备用。

1.3.2 苹果渣厌氧发酵制氢试验 试验装置见图1。

（1）苹果渣与活性污泥的比例对产氢效率的影响：在500mL蓝盖瓶中加入50g预处理过的活性污泥，分别按苹果渣∶活性污泥为1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，5∶10，6∶10，7∶10，8∶10，9∶10，10∶10的比例加入苹果渣。加自来水至约350mL，以0.1%氢氧化钠和1%盐酸调整pH至6.5，以自来水补充体积至400mL，然后密封，氮气吹扫瓶中的空气5min，置于（35±2）℃水浴中厌氧发酵，用排水法收集气体，发酵结束后，进行气相产物成分分析。

图1 500mL批式厌氧发酵产氢试验装置Figure 1 Apparatus for hydrogen production of 250mL batch test

（2）发酵温度对产氢效率的影响：加入50g预处理过的活性污泥，加入25g苹果渣，加自来水至约200mL，以0.1%氢氧化钠和1%盐酸调整pH至6.5，加自来水至约350mL，以0.1%氢氧化钠和1%盐酸调整pH至6.5，以自来水补充体积至400mL，氮气吹扫瓶中的空气5min，分别置于（35±2），（50±2）℃和室温（（20±3）℃）水浴中厌氧发酵，收集气体。

（3）初始pH对产氢效率的影响：加入50g预处理过的活性污泥，加入25g苹果渣，加自来水至约200mL，以0.1%氢氧化钠和1%盐酸调整pH 至5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，加自来水至约350mL，以0.1%氢氧化钠和1%盐酸调整pH至6.5，以自来水补充体积至400mL，氮气吹扫瓶中的空气5min，分别置于（35±2）℃水浴中厌氧发酵，收集气体。

（4）发酵液浓度对产氢效率的影响：固定苹果渣和活性污泥的比例为5∶10作为底物，发酵液浓度分别为0.025，0.050，0.075，0.10，0.125，0.150，0.175，0.20，0.225g/mL，以0.1%氢氧化钠和1%盐酸调整pH至6.5，加自来水至约350mL，以0.1%氢氧化钠和1%盐酸调整pH至6.5，以自来水补充体积至400mL，氮气吹扫瓶中的空气5min，分别置于（35±2）℃水浴中厌氧发酵，收集气体。

（5）苹果渣厌氧发酵制备氢气条件的优化：在单因素试验的基础上，采用（30±2）℃中的温发酵方式，选择活性污泥与苹果渣比率、初始pH和发酵液浓度为考察因素，以厌氧发酵过程中累积产氢量为指标，设计L9（34）正交试验，进一步优化氢气的制备工艺参数。

1.4 分析测定方法

1.4.1TS和VS的测定TS和VS按式（1）和（2）计算。

式中：

Wsd——样品干重，g；

Ws——样品重，g；

Wa——样品灰分重，g。

1.4.2 苹果渣累积产氢量计算 按式（3）计算。

式中：

Gt——累积产气量，mL/g TS；

GH——收集气体中氢气的总量，mL；

W——苹果渣的质量，g；

TS——苹果渣中的总固形物含量，%。

1.4.3 生物气中H2组分的百分含量测定 采用气相色谱法测定。

（1）测定条件：采用SP2000气相色谱仪，热导检测器（TCD）。PorapakQ6英尺不锈钢填充柱（80/100Mesh），柱温恒温35℃；载气为N2，流速20mL/min；检测器电流和温度分别是60mA、100℃；进样器不分流，进样温度50℃。

（2）用外标法定量：以相同体积的标准纯气体作为外标物注入色谱柱，得到标准色谱图。然后在相同条件下，对待测样品进行检测，得到其色谱图。同一种气体在色谱图中显示相同的保留时间，以同体积标准气为标准，根据峰面积可计算得出生物气中各气相产物浓度。气相产物浓度按式（4）计算：

式中：

CH——生物气中H2组分的百分含量，%；

CSH——标准纯氢气的百分含量，%；

AA——生物气中H2的峰面积；

ASH——标准纯H2的峰面积。

2 结果与分析

2.1 活性污泥与苹果渣的比例对产氢效率的影响

由图2可知，在活性污泥与苹果渣比例在1∶10到5∶10之间时，苹果渣厌氧发酵产氢的得率较高，随着活性污泥与苹果渣比例进一步增大，苹果渣厌氧发酵产氢的得率逐渐下降。分析其中原因，在厌氧发酵过程中，随着有机物质的水解，发酵体系中的pH逐渐下降，过低的pH将抑制产氢菌的活性。因此，本试验选取活性污泥与苹果渣的比例4∶10，5∶10，6∶10作为正交试验的考察水平。

图2 活性污泥与苹果渣的比例对产氢效率的影响Figure 2 The effect of sluge to apple pomace ratio on hydrogen production from apple pomace

2.2 发酵温度条件对苹果渣产氢量的影响

由图3可知，高温发酵（50±2）℃时，苹果渣厌氧发酵产氢效率最高，中温（35±2）℃次之，室温（20±3）℃产氢效率较低。分析其原因可能是在试验的（50±2）℃高温条件下，产氢菌的发酵活性没有受到抑制，而高温有利于苹果渣水解，利于底物的转化。但是维持较高的发酵温度需要更多的热能，发酵成本高。因此本试验选取中温发酵（35±2）℃为苹果渣适宜的发酵温度条件。

图3 发酵温度条件对苹果渣产氢量的影响Figure 3 The effect of temperature on hydrogen production from apple pomace

2.3 初始pH对苹果渣厌氧发酵产氢效率的影响

由图4可知，在初始pH值等于5.0时，几乎没有氢气产生。当初始pH值为6.0～8.0时，苹果渣的累计产氢量随初始pH值的上升而增加。初始pH 8.0时，累计产氢量最大，达到18.51mL/g TS。初始pH值大于8.5后，苹果渣的累计产氢量开始下降。分析其中原因，可能是因为本试验选用的活性污泥预处理方式是碱处理法，得到产氢菌耐碱而不耐酸，偏碱性的环境有利于其萌发、生长、繁殖和发酵。这与顾顺等人的研究结果［8－10］一致。本试验选适宜的初始pH范围为6.5到8.5。

图4 初始pH对苹果渣厌氧发酵产氢效率的影响Figure 4 The effect of initial pH on hydrogen production from apple pomace

2.4 发酵液浓度对苹果渣产氢量的影响

由图5可知，在试验范围内，发酵液产氢量较高，继续增大发酵液浓度，累积产氢量逐渐下降。分析原因，可能是过高的底物浓度影响发酵中传质，产氢菌和底物接触受到影响，另一方面，高浓度的底物在发酵过程中很快降低了反应体系的pH，使得发酵受到抑制。本试验选取适宜的底物浓度为0.075～0.125g/mL。

图5 发酵液浓度对苹果渣厌氧发酵产氢效率的影响Figure 5 The effect of fermentation broth content on hydrogen production from apple pomace

2.5 苹果渣厌氧发酵制备氢气条件的优化

正交试验因素水平表见表1，试验设计及结果见表2。

由表2可知，在试验条件下，影响苹果渣厌氧发酵累计产氢量的3个因素中，按极差大小其主次顺序为B＞A＞C；优组合为A1B3C3，即活性污泥与苹果渣比率为0.4、初始pH值8.5、发酵液浓度0.125g/mL，在此条件下，苹果渣产氢率达到19.29mL/gTS。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal design L9（34）

表2 正交试验结果Table 2 Result of Orthogonal experiment

3 结论

以氢氧化钠调整活性污泥pH为11，处理时间为1.5h，然后用盐酸调整至pH 6.5的条件下，苹果渣液态厌氧发酵制备氢气的最佳条件：选用（30±2）℃的中温发酵方式，活性污泥与苹果渣比率为4∶10、初始pH值8.5、发酵液浓度0.125g/mL，在此条件下，苹果渣产氢率达到19.29mL/g·TS。

1 Li C C，Fang H H P.Fermentative hydrogen production from wastewater and solid wastes by mixed culture［J］.Crit Rev.Env.Sci.Technol，2007，37：1～39.

2 张全国，尤希凤，张军合.生物制氢技术研究现状及其进展［J］.生物质化学工程，2006，40（1）：27～31.

3 樊耀亭，李晨林，侯红卫，等.天然厌氧微生物氢发酵生产生物氢气的研究［J］.中国环境科学，2002，22（4）：370～374.

4 张淑芳，樊耀亭.玉米芯发酵法生物制氢［J］.生物工程学报，2008，24（6）：1 085～1 090.

5 李丽，罗仓学，王白鸥，等.苹果渣中纤维素、半纤维素的提取分离［J］.食品科技，2008（1）：132～136.

6 吕磊，徐抗震.鲜苹果渣不同处理方式的成分变化研究［J］.饲料工业，2006，27（13）：52～53.

7 顾顺.水稻秸秆和苹果渣发酵制备高氢生物气的研究［D］.镇江：江苏大学，2008.

8 冯小琼.苹果渣厌氧发酵生物制氢的研究［D］.西安：西北大学，2009.

9 李扬.玉米秸秆厌氧发酵制氢实验研究［D］.郑州：郑州大学，2006.

10 李智.葡萄糖和苹果渣厌氧发酵生物制氢的研究［D］.西安：西北大学，2008.

Biohydrogen production from apple residue by liquid－state anaerobic fermentation

MA Xiao－ke1WANG Zhen－bin2CHEN Ke－ping1WANG Qian－qian2，3WANG Shi－qing3

（1.Dept.of Life Science，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu212013，China；2.Dept.Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu212013，China；3.Dept.Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong266109，China）

Biohydrogen was produced from apple pomace by anaerobic fermentation in liquid state.The effects of ratio of apple pomace to sludge，fermentation temperature，initial pH and solid content of fermention solution on the biohydrogen production were investigated by single factor tests and orthogonal tests.The optimum liquid state anaerobic fermenting parameters for hydrogen producing from apple pomace were as follows：fermentation temperature 30±2℃，ratio of sludge to apple pomace 4：10，initial pH value 8.5，solid content of fermention system 0.125g/mL.In this conditions，the total hydrogen rate reached to 19.29mL/gTS（TS：total solid）.

apple pomace；liquid－state fermentation；anaerobic fermentation；biohydrogen

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.063

镇江市科技攻关项目（编号：GY2007002）；镇江市国际科技合作项目（编号：GJ2007010）

马晓珂（1974－），女，江苏大学实验师，硕士。E－mail：maxk2008＠jus.edu.cn

王振斌

2011－08－01