一株油脂降解菌的性能研究

齐香君，徐婷婷，张雯，冉登元

(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安，710021)

一株油脂降解菌的性能研究

齐香君，徐婷婷，张雯，冉登元

(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安，710021)

为 寻找高效的油脂降解菌，从餐厅油烟排出口附近筛选出一株油脂降解菌QZX-A，并采用形态学、生理生化鉴定、基因测序等方法对其进行分类鉴定;采用比浊法和称重法对该菌株的生长性能进行研究;采用排油圈法及蒽酮硫酸法研究了QZX-A菌株生产鼠李糖脂的性能。结果:形态学指标、生理生化指标均显示QZX-A菌株具备铜绿假单孢杆菌的特征，基因测序结果表明QZX-A菌株基因序列与铜绿假单孢杆菌序列的相似度达98%;QZX-A菌株在牛肉膏蛋白胨培养基和发酵培养基中具有相似的生长曲线，但前者的生长速率大于后者;QZX-A菌株代谢产物属于糖脂类化合物，其排油圈可达11 cm，产量为567.75 mg/L。QZX-A菌株遗传性状稳定。

油 脂降解，铜绿假单胞菌，鼠李糖脂

随着餐饮业蓬勃发展，餐饮废水日益增多。这些油脂废水如不经处理排放后会飘浮于水体表面，影响水体的复氧及其自然净化过程，危害水体生态系统并且对周围环境造成严重污染［1］。因此，找到一种简便、快速、高效的方法来处理餐饮废水中的油脂，以解决这一刻不容缓的环境问题。本研究根据Bergey系统和常见细菌鉴定方法结合基因测序等方法对从教职工餐厅油烟排污口分离出的能利用菜籽油的细菌QZX-A进行分类鉴定研究;利用比浊法和重量法对该菌株的生长性能进行研究;应用蒽酮硫酸法及排油圈法，研究了QZX-A菌株代谢鼠李糖脂的生产性能。通过测定多次传代后QZX-A菌株的形态和鼠李糖脂的生产能力研究了该菌株的遗传性能。这为该菌株的开发应用研究奠定基础。

1 试药与仪器

1.1 QZX-A菌株来源

教职工餐厅油烟排出口分离筛选得到。

1.2 培养基配制

(1)分离培养基:KH2PO40.05%，K2HPO40.1%，(NH4)2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.01%，NaCl 0.5%，菜籽油3 mL/L，混合乳化剂(司盘-80∶吐温-80=1∶1.14)5 mL/L，琼脂 2%，pH 7.5;(2)发酵培养基:KH2PO40.05%，K2HPO40.05%，(NH4)2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.01% ，菜籽油2%，pH8;(3)保藏培养基:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH7.5

1.3 显色剂配制

(1)茚三酮显色剂:0.5 g茚三酮溶于100 mL的无水丙酮中;(2)蒽酮显色剂:1 g蒽酮和5 mL硫酸溶于95 mL的乙醇中。

1.4 主要仪器设备

DPX-9082B-1培养箱，HYG-Ⅱa回转式恒温调速摇瓶柜，752型紫外分光光度计

2 试验方法

2.1 蒽酮硫酸法

取适当稀释倍数的发酵液1.0 mL置试管中，于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮试剂4 mL，加完后混合均匀浸于沸水浴中，15 min后取出，用自来水冷却，室温放置20 min。空白对照以未接种的培养基代替发酵液，620 nm处进行紫外检测［2］。

2.2 排油圈法

取一直径20cm培养皿，加入200 mL蒸馏水，水面中央加250μL液体石蜡形成油膜。在油膜中心加250μL发酵液，中心油膜被挤向四周形成排油圈，记录排油圈的直径［3］。

2.3 菌种鉴定

2.3.1 形态学研究

采用菌落观察、染色及显微观察的方法，对菌落大小、性状、光泽、颜色、硬度、透明度，菌体显微形态(100×)，革兰氏染色，以及是否运动，是否产色素等方面对菌体进行详细描述，根据Bergey系统进行分类［4］。

2.3.2 生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》［4］，对筛选得到的菌株进行接触酶实验、葡萄糖氧化发酵实验、甲基红(M.R)实验、V-P测定、吲哚实验等生理生化试验。

2.3.3 16srDNA序列测定

①将QZX-A菌株纯培养物于12 000 r/min离心3 min，收集菌体加入2.7 mL DNA抽提Buffer，充分悬浮，加入20 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，37℃振荡30 min。②加入0.3 mL 20%SDS，混匀后于65℃恒温静置2 h，期间每20 min上下颠倒几次，12 000 r/min离心10 min。③将上清液转至离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1，V/V)抽提 10 min，于 12 000 r/min离心10 min。重复该步骤1次。④将上清转至离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置1 h后于14 000 r/min离心10 min收集粗DNA。⑤沉淀的粗DNA用70%冰乙醇轻轻刷洗，弃刷洗液后晾干。⑥加入无菌超纯水溶解DNA后用核酸/蛋白分析仪于Nucleic Acid程序下测定其浓度。⑦PCR扩增反应程序:94℃5 min;94℃30 min，56℃30 min，72℃2 min，30个循环;72℃，10 min。⑧取扩增产物5μL电泳，于UVI凝胶成像系统分析结果。⑨将扩增产物送上海英骏生物技术有限公司进行测序。测序结果用Blast软件进行同源性比较［3］。

2.4 不同培养条件下的生长特性

分别绘制QZX-A菌株在牛肉膏蛋白胨培养基和发酵培养基中生长曲线:采用比浊法和称重法［5］。

2.5 QZX-A菌株生产鼠李糖脂性能研究

2.5.1 代谢产物的定性

取30℃，130 r/min培养3 d的发酵液及表面活性剂粗品进行TLC层析，以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶10∶0.5为展开剂，用不同的显色剂显色:(1)茚三酮显色剂，脂肽显红色;(2)蒽酮显色剂，糖脂显黄色斑点。

2.5.2 排油性能

取30℃，130 r/min培养3 d的发酵液，适当稀释后，采用排油圈法，记录排油圈直径，初步判断产物中是否含表面活性剂及含量多少。

2.5.3 产鼠李糖脂性能

取30℃，130 r/min培养3 d的发酵液，适当稀释后，采用蒽酮硫酸法测定发酵液中鼠李糖的量。鼠李糖脂产量=×3×n(n=发酵液稀释倍数)。

2.6 遗传稳定性考察

采用牛肉膏蛋白胨固体培养基连续传代的方法，通过对每代菌种进行形态学观察;通过发酵培养基液体培养测定其代谢产物鼠李糖脂的含量，研究QZXA菌株的遗传稳定性。

3 结果与讨论

3.1 QZX-A菌株的鉴定

3.1.1 形态学鉴定

菌落呈圆形，边缘整齐，直径2mm左右，表面湿润，薄，中间略突起，在含油平板上有较明显的透明圈，如图1(A)。显微镜下(100×)QZX-A菌株为短杆状细菌，末端钝圆，革兰氏阴性，无芽孢，不运动，如图1(B)。产绿色素，平板培养后期绿色素浸透整个平板，在牛肉膏蛋白胨液体培养基中呈均匀混浊状态，绿色素分布在液面附近，如图1(C)所示。

图1 QZX-A形态学鉴定

3.1.2 生理生化鉴定

对QZX-A菌株进行糖发酵、过氧化氢酶等生理生化试验。该菌株的生理生化特征见表1。

表1 QZX－A菌株的生理生化特征

3.1.3 基因测序鉴定

将测序结果与GenBank中已报道的基因序列进行同源性比较，发现QZX-A与铜绿假单胞菌的同源性达到98%，与其同源性最接近的菌种为Pseudomonas aeruginosa(AY825034)。

综上分析表明，QZX-A的形态学观察结果、生理生化指标与假单孢菌属的特性完全吻合，测序结果与GenBank中的序列进行同源性比较，发现QZX-A与铜绿假单胞菌的同源性达到98%，。因此确定QZXA为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。上传其基因序列至 NCBI Genbank，得到该菌株序列号HQ221563。

3.2 QZX-A菌株在不同培养条件下的生长特性

为掌握该菌株的生长特性，测定了该菌株在牛肉膏蛋白胨培养基和发酵培养基中的生长曲线，结果见图2，可以看出，牛肉膏蛋白胨培养基中菌体12 h已进入稳定期，发酵培养基中菌体在30 h才进入稳定期。在发酵培养基中的对数期比牛肉膏蛋白胨培养基中QZX-A的对数期延长18 h。其原因可能是微生物对油脂的利用速度较慢。

图2 不同培养条件下QZX-A的生长性能

3.3 代谢产物生产性能研究

3.3.1 代谢产物的定性

为判断代谢产物类别，利用TLC法对其进行鉴别。对分离的斑点经蒽酮显色剂显色后，鼠李糖脂粗提物与发酵液都显黄绿色斑点，鼠李糖脂粗提物斑点略大于发酵液斑点，判断此种表面活性剂为糖脂类化合物，Rf=0.567。文献表明铜绿假单孢杆菌有产鼠李糖脂的性能，因此可推断代谢产物中含有鼠李糖脂。

3.3.2 排油圈的测定

为初步测试研究菌株代谢鼠李糖脂的能力，取不同培养时间的发酵液测其排油圈直径，结果见图3。由图可知，排油圈的直径随着发酵时间的递增而增大，60h后增加趋势逐渐减缓，120 h发酵液的排油圈直径达11.2 cm。

3.3.3 鼠李糖脂的定量测定

为了准确了解QZX-A菌株产鼠李糖脂的能力，对30℃，130 r/min培养不同时间的QZX-A菌株发酵液采用蒽酮硫酸法测定其鼠李糖脂的量，结果见图3，鼠李糖脂产量在60 h前快速增长，60 h后趋于平缓，略有升高，120 h时鼠李糖脂的产量达1 286 mg/L。曲线趋势平缓表明60 h后菌株产鼠李糖脂的能力基本达到最大，为后期发酵条件的考察打下基础。

图3将不同发酵时间的排油圈直径变化与鼠李糖脂产量变化做了比较，发现两者的变化趋势一致，60 h前呈快速增长趋势，60 h后呈较平稳趋势。由此推断，发酵液的排油圈直径与鼠李糖脂含量成正比关系。由于排油圈的测量较简便快捷，可采用排油圈法代替蒽酮硫酸法初步判断菌种产鼠李糖脂的能力。

3.4 遗传稳定性考察

为了解实验菌株的遗传稳定性，在固体斜面连续传代10次，对每代的QZX-A菌株进行形态学观察、定量测定发酵液鼠李糖脂含量，结果表明QZX-A产鼠李糖脂的性状稳定，转接10代的平均产量为1 057.75 mg/L。

经形态学观察，QZX-A菌株多次传代后在外观形态，色素产生方面都与原始菌株保持一致，表明QZX-A菌株的具有良好的遗传稳定性。

图3 QZX-A产鼠李糖脂性能

4 结论

(1)本研究所用菌株QZX-A，为假单孢菌属的铜绿假单孢菌。

(2)QZX-A菌株在降解油脂的过程中能够产生表面活性剂，初步鉴定为鼠李糖脂。

(3)120h内QZX-A菌株发酵液的排油圈直径与发酵液中鼠李糖脂含量成正比关系。60 h后鼠李糖脂产量的增加趋于平缓，120h时鼠李糖脂的产量最大，达到1 286 mg/L。

(4)QZX-A菌株在10代内，其外观形态、产色素性能、产鼠李糖脂能力等遗传性状稳定。

［1］ 袁惠民.含油废水的处理方法［J］.化工环保，1998，18:146.

［2］ 卢满国，刘红玉，曾光明，等.鼠李糖脂快速定量分析及其影响因素研究［J］.微生物学通报，2006，33(4):106－111.

［3］ 贾燕，尹华，彭辉，等.一株表面活性剂产生菌的筛选及其特性研究［J］.微生物学通报，2007，34(6):1 066－1 070.

［4］ 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京:科学出版社，2001.

［5］ 周德庆.微生物学教程［M］.北京:高等教育出版社，2002.

Research on the Property of an Oil-degrading Bacteria

Qi Xiang-jun，Xu Ting-ting，Zhang Wen，Ran Deng-yuan
(Colloge of Life Science and Engineering in Shaanxi university of Science and Technology，Xi＇an 710021，China)

In order to select a high-efficient oil-degrading bacteria，here an oil-degrading bacteria was selected from the lampblack exit of the restaurant，which was named QZX-A.Then，it was identified using the methods such as morphological，physiological and biochemical identification and 16S rRNA.At the same time，its growth performance was anaylzed by the turbidimetric and weighing methods.Furthmore，its ability to produce rhamnolipid was discussed by the method oil-spreading and anthrone-sulfuric acid.Results:On the basis of morphological，physiological and biochemical evidence，strain QZX-A had the characteristics of Pseudomonas aeruginosa bacteria.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences revealed that QZX-A belonged to a phyletic sub-lineage within the family Pseudomonas，with≥98%16S rRNA gene sequence similarity to the described species.In addition，strain QZX-A had a similar growth curve in beef extract peptone and fermentation medium，but the growth rate of the former was bigger than the latter.The result of TLC showed that the metabolic products of strain QZX-A belonged to glycolipid compounds.The oil-spreading round was up to 11cm，and its productivity was 567.75 mg/L.In sum，since strain QZXA was genetically stable，it had some value of development in the degradation of oil and in the production of rhamnolipid.

oil-degradation，Pseudomonas aeruginosa，rhamnolipid

硕士，教授。

2010－09－06，改回日期:2010－10－14