怀牛膝多糖的超声波辅助提取工艺及其抗氧化性活性*

魏涛，何培新，封盛雪，魏东芝

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州，450002)

怀牛膝多糖的超声波辅助提取工艺及其抗氧化性活性*

魏涛，何培新，封盛雪，魏东芝

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州，450002)

研 究怀牛膝多糖的超声波提取工艺和抗氧化性。在单因素实验基础上采用正交实验得出超声波提取怀牛膝多糖的适宜工艺条件，即超声波功率1 000 W、提取温度60℃、提取时间60 min、料液比(g∶mL)1∶30。在此提取工艺条件下，粗多糖得率为6.1%。体外抗氧化性实验表明，所提取怀牛膝多糖具有较好的抗氧化性，对H2O2、O2－·和·OH的清除率分别可达到75.1%、90.3%和61.3%。

怀 牛膝，多糖，超声波提取，抗氧化性

牛膝(Achyranthes bidentata Blume)为苋科多年生草本植物，其干燥根具有药用价值，可用来治疗肝阳眩晕，产后腹痛，跌打损伤等病症［1］。牛膝多糖(achyranthes bidentata polysaccharides，ABPS)是牛膝的主要药效成分之一，具有延缓衰老、调节机体免疫力和抗肿瘤、降血糖、治哮喘等多种功效［2］，具有广阔的药物开发及应用前景。牛膝主要分为怀牛膝和川牛膝2种，前者主产河南省，后者主产于四川省、贵州省、云南省、福建等地。本文的研究对象为怀牛膝。

本研究在传统水提法的基础上，利用超声波辅助处理，在单因素实验基础上采用正交实验得出提取牛膝多糖的适宜工艺，并对提取的多糖进行抗氧化性的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

半干牛膝片(河南怀牛膝)，购自河南省焦作市武陟县。

核黄素(南京桂辉化工);L-蛋氨酸(张家港市华昌药业有限公司);硫代巴比妥酸(上海锐聪科技发展有限公司);98%H2SO4，无水乙醇，正丁醇，苯酚，三氯甲烷等试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

电热鼓风干燥箱(上海左科仪器设备有限公司)，旋转蒸发器RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)，JY96-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，SHB-3循环水多用真空泵(郑州杜甫仪器厂)，索氏提取仪(上海洪纪仪器设备有限公司)，紫外可见光分光光度计(上海分析仪器总厂)，台式离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)等。

1.3 提取方法

1.3.1 怀牛膝多糖提取工艺流程［3］

怀牛膝→70℃干燥→粉碎过40目筛→石油醚脱脂，体积分数80%乙醇回流→超声波辅助水浸提→离心取上清液→Sevage法除蛋白→浓缩→乙醇沉淀→过滤洗涤→低温干燥→怀牛膝粗多糖

1.3.2 操作要点

称取6 g怀牛膝粉置于索氏提取器中，加入石油乙醚(60～90℃)200 mL，90℃ 回流脱脂5 h;脱脂之后加入体积分数80%乙醇，90℃回流2次(每次2 h)，除去单糖、多酚、低聚糖和皂苷等小分子物质;乙醇挥发后，按照不同的超声功率、浸提时间、浸提温度和料液比进行怀牛膝多糖提取。将提取的怀牛膝多糖，旋转蒸发仪真空浓缩，加体积分数95%乙醇析出多糖，沉淀物用蒸馏水复溶后再加体积分数95%乙醇醇析，反复3次，将沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥，得怀牛膝水溶性多糖。采用Sevage法去除提取怀牛膝多糖中的蛋白质，少量蒸馏水溶解怀牛膝多糖，按粗多糖溶液与三氯甲烷-正丁醇(体积比4∶1)混合液以体积比5∶1混合，充分振荡30 min静止分层，4 200 r/min离心15 min，将中间液面白色物质和下层的有机溶剂除去。用旋转蒸发器将上清液真空浓缩至原液的1/4～1/5左右。向浓缩液加入4倍体积的无水乙醇，在4℃的冰箱内放置12 h，然后5 000 r/min离心15 min，收集沉淀，用无水乙醇洗涤2次，干燥后即得怀牛膝粗多糖。

1.3.3 怀牛膝多糖得率和含量的测定方法

多糖得率的计算方法:粗多糖得率(%)=粗多糖的质量(g)/怀牛膝粉的质量(g);多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准样品。

1.4 不同单因素对怀牛膝多糖提取效果的影响

1.4.1 超声功率

在提取时间40 min，料液温度50℃，料液比(g∶mL)1∶20的条件下，分别采用表1中各功率，提取怀牛膝多糖。

1.4.2 料液温度

在超声功率600 W，提取时间40 min，料液比1∶20的条件下，分别采用表1中温度，提取怀牛膝多糖。

1.4.3 提取时间

在超声功率600 W，提取温度50℃，料液比(g∶mL)1∶20的条件下，分别采用表1中提取时间，提取怀牛膝多糖。

1.4.4 料液比

在超声功率600 W，提取时间40 min，提取温度50℃，分别采用表1中料液比，提取怀牛膝多糖。

表1 怀牛膝多糖提取工艺中各因素水平

1.5 怀牛膝多糖提取工艺条件的优化

以怀牛膝多糖得率为考察指标，在单因素试验的基础上进行L9(34)用正交实验法，优化怀牛膝多糖最佳提取工艺。

1.6 多糖抗氧化性活性的测定

1.6.1 怀牛膝多糖对·OH的清除作用

采用辣根过氧化酶法［4］:取一定浓度的怀牛膝多糖溶液0.1 mL，加入0.1 mL H2O2(10 mmol/L)在室温放置30 min，再加入0.1 mL辣根过氧化物酶(0.3 mol/mL)，反应10 min后在波长610 nm测定吸光度，对照组以蒸馏水代替多糖，计算清除率。

1.6.2 怀牛膝多糖对·OH的清除作用

利用 Fenton反应产生·OH，采用 2-脱氧-D-核糖法测定怀牛膝多糖对·OH的清除作用［5］:试管中依次加入0.6 mL KH2PO4-KOH缓冲液(50 mmol/L，pH值7.4)，0.15 mL一定浓度的多糖溶液，0.15 mL EDTA 溶液(1 mmol/L)，0.15 mL FeCl3(1 mmol/L)，0.15 mL H2O2(12 mmol/L)，0.15 mL 2-脱氧-D-核糖(60 mmol/L)和0.15 mL抗坏血酸(2 mmol/L)。然后将试管置于37℃水浴锅中水浴1 h，取出后迅速加入1.5 mL 25%HCl和1.5 mL 1%硫代巴比妥酸(TBA)，在沸水中加热20 min后取出，冷却，于532 nm处测定吸光度值，对照组以蒸馏水代替待测样品。按照下式计算清除率:

1.6.3 怀牛膝多糖对O2－·自由基的清除作用

采用核黄素-光照法［6］:用磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L，pH值7.8)分别配制0.1 mmol/L NBT溶液，0.1 mmol/L核黄素溶液，0.1 mol/L L-蛋氨酸溶液。在试管中依次加入0.075 mL提取怀牛膝多糖样品，0.3 mL NBT，0.15 mL L-蛋氨酸，0.15 mL 核黄素和4.4 mL磷酸盐缓冲液，混匀，对照组以蒸馏水代替待测样品。在暗箱光照30 min之后在560 nm处测定吸光度值。按照下式计算清除率:

2 结果与分析

2.1 怀牛膝多糖提取单因素试验结果

采用超声波辅助水提法，以怀牛膝多糖得率为指标，分别进行影响怀牛膝得率的主要单因素试验，结果如图1所示。多糖得率随超声功率的增加呈现升高趋势，至800 W时多糖得率达到5.31%，以后趋于平缓。提取温度对多糖得率影响显著，到70℃达到最大6.0%，高温有助于怀牛膝细胞壁膨胀破裂，加速多糖溶解。提取时间在20、40、60 min的多糖得率分别为3.4%、4.4%、5.6%，到80 min时，多糖得率不再增加，表明多糖已基本提取完全。随着料液比增加，多糖得率提高，但随着加水量增大，多糖得率有所下降。

图1 单因素不同条件下的怀牛膝多糖含量

2.2 怀牛膝多糖超声波提取最佳工艺参数优化正交试验结果

在单因素试验基础上，以超声功率，提取温度，提取时间和料液比做4因素3水平L9(34)的正交试验设计，对怀牛膝多糖提取工艺进行优化筛选，实验结果和极差分析见表2和3。

表2 超声波辅助提取怀牛膝多糖工艺参数优化L9(34)正交试验筛选结果

表3 超声波辅助提取怀牛膝多糖最佳工艺正交试验结果方差分析

从极差结果得出，影响多糖提取率的因素大小为RA＞RB＞RC＞RD，即提取温度＞提取时间＞超声功率＞料液比。方差分析结果表明，提取温度对怀牛膝多糖提取率影响显著;超声功率、提取时间和料液比对怀牛膝多糖提取率影响不显著。因此，最佳提取条件为A2B3C3D3，即超声功率1 000 W，提取温度为60℃，提取时间为60 min，料液比为1∶30。在此条件提取怀牛膝多糖提取率为6.1%。

2.3 怀牛膝多糖对H2O2的清除作用

H2O2是氧化反应的中间产物，具有较活泼的化学性质，极易形成自由基，在反应体系中对H2O2的清除率越高，表明对活性氧的清除作用越强，实验结果如图2所示。怀牛膝多糖对H2O2具有一定的清除作用，随着多糖浓度增加其清除率逐渐上升，当多糖浓度为6 mg/mL时，清除率与Vc大致相同;当多糖浓度达到12 mg/mL时，对H2O2的清除率达到最大值75.1%，清除率明显高于VC(58.1%)，说明怀牛膝多糖的抗氧化能力优于VC。

图2 怀牛膝多糖对H2O2清除效应

2.4 怀牛膝多糖对O2－·的清除作用

O2－·是所有氧自由基中的第一个自由基，可以经一系列反应生成其他氧自由基，与许多疾病密切相关，因此测定怀牛膝多糖对超氧阴离子自由基的清除作用具有重要的意义。由图3可知，怀牛膝多糖对·具有清除能力，并且清除率随着浓度的增大而增大。当浓度达到12 mg/mL时，怀牛膝多糖对·清除率为90.3%，高于Vc的清除率82.1%，说明怀牛膝多糖对·的抗氧化能力优于。

图3 怀牛膝多糖对超氧阴离子自由基清除效应

2.5 怀牛膝多糖对·OH的清除作用

图4 怀牛膝多糖对羟基自由基清除效应

羟自由基的化学性质极为活泼，也是毒性最大的自由基，可以与多种有机物或无机物反应。怀牛膝多糖对·OH作用效果见图4。随着多糖浓度增加，·OH的清除率逐步提高，当多糖浓度为12 mg/mL时，·OH的清除率达到61.3%，低于Vc对·OH的清除率75%，说明怀牛膝多糖对·OH的抗氧化能力低于Vc。

3 结论

本研究在超声波功率、提取温度、提取时间和料液比各单因素实验基础上，采用正交实验得出了超声波辅助提取怀牛膝多糖的最佳工艺条件，即超声波功率1 000 W，提取温度60℃，超声时间60 min，料液比(g∶mL)1∶30。采用该工艺提取怀牛膝多糖，怀牛膝多糖得率为6.1%。本实验结果表明怀牛膝多糖具有较好的抗氧化活性，对H2O2、O2－·和·OH的清除率可分别达到75.1%、90.3%和61.3%。从怀牛膝多糖对H2O2、O2－·和·OH的清除率可知，怀牛膝多糖对各种形式的活性氧均有清除作用，并且清除率与多糖浓度有关。其原因可能是多糖分子上具有还原性的半醛酸羟基，可与活性氧发生氧化还原反应［7］。

［1］ 中华人民共和国药典委员会编.中华人民共和国药典［M］.北京，化学工业出版社，2000.

［2］ 黄芳，蒙义文.活性多糖的研究进展［J］.天然产物研究与开发杂志，1999(2):90－98.

［3］ 李金忠，马海乐，吴沿友，等.超声波提取山药多糖的研究［J］.粮油食品科技，2005，13(5):14－15.

［4］ 舒媛，刘安军，王丽霞.山药多糖结合蛋白对抗氧化作用的影响［J］.食品研究与开发，2006，27(11);39－42.

［5］ 焦中高，刘杰超，王思新，等.黑莓红色素对活性氧自由基和亚硝基的清除作用［J］.食品工业科技，2004，25(4):127－128.

［6］ 广东淮山水溶性多糖的分离纯化及体外抗氧化活性的研究［J］.食品科学，2003，24(11)129－133.

［7］ 李玲，陈常秀.大枣多糖的分离及抗氧化性研究［J］.食品研究与开发，2009，30(9):49 －51.

Study on the Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Polysaccharides from Achyranthes bidentata Blume and Its Anti-oxidant Activities

Wei Tao，He Pei-xin，Feng Sheng-xue，Wei Dong-zhi
(School of Food and Biological Engineering Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

The ultrasonic-assisted extraction technology of crude polysaccharide from Achyranthes bidentata Blume and its antioxidant activities of the polysaccharide were investigated.On the basis of single factor test，extraction technology condition was optimized by orthogonal test.Our results showed the best extracting condition was as follows:ultrasonic power 1 000W，extracting temperature 60℃，extracting time 60 min，and material-water ratio 1∶30.Under the above conditions，the extraction rate of the crude polysaccharide can reach to 6.1%.Meanwhile，the scavenging activity of the polysaccharide on H2O2，O－2· and ·OH free radicals were both significant.The clearance rates was up to 75.1%，90.3%and 61.3%respectively.

Achyranthes bidentata Blume，polysaccharide，ultrasonic extraction，antioxidative activity

博士，讲师。

*河南省科技厅重点科技攻关项目(102102210063);郑州轻工业学院博士科研基金(000544)

2010－09－13，改回日期:2010－12－03