动物性食品源空肠弯曲杆菌二重PCR检测方法的建立及应用*

陈荀，张晓利，刘书亮

(四川农业大学食品学院，四川雅安，625014)

动物性食品源空肠弯曲杆菌二重PCR检测方法的建立及应用*

陈荀，张晓利，刘书亮

(四川农业大学食品学院，四川雅安，625014)

根 据GenBank空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni，Cj)的16S rDNA及hip O(编码马尿酸酶基因)序列设计两对特异引物，建立检测动物性食品源Cj的二重PCR方法，并应用于样品检测。结果显示只对Cj能特异的扩增出699bp和366bp两个基因片段，而大肠杆菌、沙门氏菌等其他11种细菌均未扩增出条带;Cj标准株ATCC33560的16S rDNA及hip O序列与GenBank其他Cj的相应序列具高度相似性(分别为99.7% ～99.9%，98.1% ～99.7%);该方法可在27h内完成，其灵敏度为2.4～16 CFU/mL;四川省雅安市鸡肉、猪肉、牛肉和牛奶样品中的Cj阳性率分别为38.0%(19/50)、28.3%(15/53)、17.1%(6/35)和8.6%(4/46)。

二 重PCR，空肠弯曲杆菌，动物性食品，检测

空肠弯曲杆菌是重要的肠道致病菌，通过食用受到污染的动物产品如未经煮熟的禽肉或生牛奶或生熟交叉污染的熟食品可引起肠道腹泻。而儿童、老人以及免疫压抑病人被感染后若不及时治疗，还会发展成更严重的疾病，如格林-巴利综合征(Guillain-Barré)、急性神经肌肉瘫痪及反应性关节炎等。在发达国家，空肠弯曲菌在腹泻病人中分离率已超过5%，年感染发病率超过50人/100，000人，分离率超过了沙门氏菌和志贺氏菌［1］。在中国，空肠弯曲杆菌也是主要的腹泻病原菌之一［2］。

由于空肠弯曲杆菌具有一种“活而不可培养”(VBNC)状态且培养条件苛刻，分离食品中的空肠弯曲杆菌较困难，常规生化方法鉴定比较繁琐，费时费力;而PCR方法以其灵敏度高、特异性强、检测快捷等优点而倍受青睐。因此，建立空肠弯曲杆菌快速、灵敏而又特异的检测方法，是有效控制和预防该类食源性疾病的关键所在。本研究针对空肠弯曲杆菌的16S rDNA和hip O基因(编码马尿酸酶基因)设计两对特异引物，成功建立了一种快速、灵敏、特异的食源空肠弯曲杆菌的二重PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

从四川雅安市各超市和农贸市场抽取鸡肉50份、猪肉53份、牛肉35份，某奶牛场抽取鲜牛奶46份。

1.1.2 实验菌种

空肠弯曲杆菌(Campylobcrterjejuni，Cj)ATCC33560、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29215、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)GIM1.228、藤 黄 微 球 菌 (Micrococcusluteus)ATCC10209、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853、肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)CICC21482、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P8、粪链球菌(Streptococcus fecal)S1、热死环丝菌(Brochothrix thermosphacta)T5、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)M2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B1，由四川农业大学食品微生物实验室保存。

1.1.3 主要药品试剂

2×long Taq PCR MasterMix、Gold View 核酸染料、DNA Maker DL2000购于北京天根生化有限公司;DNA胶回收试剂盒，pMD18-T Vector、Ligation Mix购于宝生物工程有限公司。其余试剂为分析纯或生化试剂。

1.1.4 培养基及抗生素

LB肉汤、布氏肉汤购自北京陆桥技术有限公司;头孢哌酮购自北京康蒂尼药业有限公司。

1.1.5 主要仪器

MyCyclerPCR 仪(Bio-RAD)，PowerPac Basic电泳仪及水平电泳槽(Bio-RAD)，凝胶成像系统(Bio-RAD)，Milli-Q Gradient超纯水系统(Millipore公司)，B4i-BR4i冷冻离心机(Thermo)等。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集与增菌培养

按微生物采样要求，将采集的肉类样品放于保鲜袋中，牛奶样品置于无菌离心管中，每个样品重约50g(mL)，3～5℃左右保存，2h内送到实验室。

将新鲜肉样剪碎混匀，取约5 g放入50 mL带螺旋口的无菌离心管中，加入布氏肉汤至离心管口1.5～2.0 cm左右，拧紧管盖，先在37℃下培养4h，再加入100 μL头孢哌酮(30 mg/L)，拧紧管盖颠倒混匀［3］，再于42℃下培养20 h。生牛奶样品先调节至pH7.6左右，4℃，10 000 r/min冷冻离心30 min后去上清液，加入布氏肉汤至接近管口1.5～2.0 cm左右，溶解沉淀，后续处理同肉样。

1.2.2 动物性食品源Cj的二重PCR方法建立

1.2.2.1 引物设计

根据GenBank公布的空肠弯曲杆菌16S rDNA及hip O基因序列利用primer5设计两对特异性引物(表1)，由invitrogen公司合成。

表1 靶基因名称、引物序列及产物大小

1.2.2.2 DNA模板提取

根据 Isabel等方法［4］提取增菌液中细菌总DNA。

1.2.2.3 PCR扩增

经过多次预实验确定PCR反应条件。PCR反应体系(25 μL):2 × Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板 1.5 μL，引物各 1 μL，双蒸水 7 μL。循环参数为:94℃预变性 4 min，94℃30 s，61.5℃30 s，72℃30 s，35个循环后 72℃延伸 6 min。将 PCR产物于1.2%琼脂糖(0.5×TBE)凝胶电泳后，观察并成像。

1.2.2.4 特异性

提取Cj标准菌株ATCC33560与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等11种细菌DNA，进行二重PCR方法的特异性考察。

1.2.2.5 扩增产物测序鉴定

对Cj标准菌株ATCC33560的16S rDNA、hip O基因扩增片段进行胶回收、再进行T克隆后由invitrogen公司测序，并进行序列分析。

1.2.2.6 敏感性试验

取Cj标准菌株ATCC33560过夜培养的布氏肉汤菌液以 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8倍稀释，然后每个稀释菌液各取1 mL分别进行平板活菌计数和提取细菌总DNA，每个浓度平行3次。平板置于42℃微需氧条件下培养48 h后进行菌落计数，用ISO［5］标准方法计算菌落总数。公式为:

式中:ξc，所有的菌落数在15～300之间的平板总菌落数之和;n1，第1个稀释度的平板个数;n2，第2个稀释度的平板个数;d，与第1个稀释度相关的稀释倍数(如 10－2)。

所提DNA用作PCR检测的模板。实验重复3次。

1.2.2.7 人工布菌

⑴样品处理。将采集到的鸡肉、猪肉、牛肉绞碎后，平铺于保鲜袋中，尽量使其与空气相接触(因为Cj为微需氧菌，在空气中暴露时间过久会死亡)，4℃存放1W。牛奶经115℃灭菌15 min。处理后样品中经二重PCR检测为阴性即可做人工布菌实验。

⑵接种。按含Cj约800 CFU/g或800 CFU/mL对处理后的鸡肉、猪肉、牛肉和牛奶接种 Cj ATCC33560，按1.2.1对样品进行增菌培养24 h。

⑶二重PCR方法检测。取增菌液1 mL提取细菌DNA，进行二重PCR检测，每种样品重复3次。

1.2.3 二重PCR方法检测食源性Cj的应用

对四川省雅安市采集的动物性食品样品按照

1.2.1 所述方法増菌后进行二重PCR检测，评价污染情况。

2 结果与分析

2.1 二重PCR方法的特异性

电泳结果(图1)表明，该两对引物仅能对空肠弯曲杆菌扩增出两个特异片段，大小分别约为700 bp和350 bp，与设计DNA片段大小相符。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、铜绿假单胞杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、粪链球菌、热死环丝菌、沙门氏菌、植物乳杆菌、奇异变形杆菌和枯草芽孢杆菌11种细菌均未有扩增产物。表明该方法具有很好的特异性。

图1 不同细菌16S rDNA、hip O基因PCR电泳结果

2.2 空肠弯曲杆菌16S rDNA、hip O基因序列分析

以ATCC33560的DNA为模板，扩增的16S rDNA、hip O基因单一基因产物序列分析表明，该菌株16S rDNA、hip O基因 PCR产物测序分别得到长699bp和366bp的片断，与设计大小相符;测得序列已在 NCBI注册，登录号分别为 GQ249178和GQ249180。采用BLAST和DNASTAR MegAlign进行基因比对分析:

ATCC33560的16S rDNA(GQ249178)与空肠弯曲菌登录号AM933373.1、AM933374.1等的16S rDNA基因序列有99.7% ～99.9%的同源性，ATCC33560的hip O基因(GQ249180)与空肠弯曲菌登录号FJ655194.1、FJ655193.1等的马尿酸钠酶相应基因序列有98.1%～99.7%的同源性。进一步表明该方法正确和特异。

2.3 二重PCR方法的敏感性

敏感性实验的PCR产物电泳结果(图2)表明，当菌液稀释至10－7倍时还能扩增出特异性片段，10－8倍稀释菌液则不能扩增特异性片段。根据公式(1)得到3次重复的原菌液浓度分别为2.4×107、1.6×108、8.2×107CFU/mL，因此该二重 PCR 方法检测的敏感度为2.4～16 CFU/mL。

2.4 人工布菌结果

用建立的二重PCR方法对人工布菌的食品样品进行检测，对经过处理后无空肠弯曲菌的鸡肉、猪肉、牛肉、生牛奶各一份进行人工布菌，经过24 h的增菌培养后都能扩增出约700bp和350bp的特异性片段(图3)，表明该二重PCR方法检测食品源空肠弯曲杆菌是可行的。

图2 二重PCR方法检测空肠弯曲杆菌敏感性的电泳结果

图3 二重PCR方法检测人工布菌的电泳结果

2.5 二重PCR方法检测动物性食品中空肠弯曲杆菌污染的调查结果

采用二重PCR方法检测动物性食品中空肠弯曲杆菌，通过PCR检测发现少数样品仅能扩增出16S rDNA片段，但并没有扩增出hip O基因片段，推测可能是弯曲菌属的其他种类;同时也有少量的样品仅能检测出hip O基因片段，如图4所示，推测可能是其他具有马尿酸钠酶基因的未知菌。本实验结果只统计能扩增出两个片段的样品为阳性。二重PCR方法检测鸡肉、猪肉、牛肉和牛奶中空肠弯曲菌的阳性率分别为 38.0%(19/50)、28.3%(15/53)、17.1%(6/35)及8.6%(4/46)。

3 讨论与结果

3.1 检测动物性食品空肠弯曲菌二重PCR方法的建立

由于空肠弯曲杆菌在食品样品中的存在量很低，培养条件苛刻且易进入VBNC状态，常规生化检测周期较长(通常为1～2 w)，且存在快速马尿酸盐水解试验假阴性和假阳性的菌株［6］，导致空肠弯曲杆菌的生化检测非常困难。随着分子生物学技术的发展，PCR方法尤其是多重PCR方法以其灵敏度高、特异性强、检测快捷等优点而越来越多地应用到病原菌的快速检测中。

本实验根据空肠弯曲杆菌16S rDNA和hip O基因序列设计两对引物，用于食品中空肠弯曲杆菌的检测。结果表明该二重PCR方法对空肠弯曲杆菌具有特异性，而对大肠杆菌、沙门氏菌等11种细菌均不能扩增出特异性片段。对空肠弯曲杆菌标准菌株ATCC33560扩增得到的16S rDNA及hip O基因的PCR产物克隆序列分析结果进一步表明该二重PCR方法具有很好的特异性。本实验建立的二重PCR方法检测限为2.4～16CFU/mL，检测周期27h，与传统空肠弯曲杆菌检测方法相比特异性更强，灵敏度高且检测周期短。袁宝君［6］等建立多重PCR方法检测限度为15CFU/mL，检测周期为 40h;何蕊［7］等建立的多重PCR方法检测限为6CFU/10 mL，但检测周期为2d;侯建军等［8］建立的 PCR方法检测灵敏度为6CFU/mL，检测周期为48h。以上数据表明本方法灵敏度较高、检测周期较短，适于食源空肠弯曲杆菌的快速检测。

另外，本实验通过二重PCR检测发现少数样品仅能扩增出16S rDNA或hip O基因的特异性片段，表明用单一的16S rDNA或hip O引物不能完全用作空肠弯曲杆菌的检测，这与文献报道一致［9］。本研究首次采用16S rDNA及hip O基因的二重PCR方法检测食源空肠弯曲杆菌，提高了方法的特异性。

3.2 二重PCR方法检测食源性空肠弯曲菌的应用及其污染情况

研究表明，零售肉类尤其是鸡肉产品中空肠弯曲杆菌污染较为普遍［10－14］。调查结果显示，四川省雅安市市售鸡肉中空肠弯曲杆菌的污染率高达38.0%，猪肉、牛肉、牛奶的污染率分别为28.3%、17.1%和 8.6%，与国内的相关报道一致［8，13］。这可能与农贸市场和街边市场零售、超市肉类中空肠弯曲杆菌的污染程度有关。由于雅安地区鸡肉、猪肉、牛肉、牛奶中空肠弯曲杆菌污染率比较高，将对消费者健康构成威胁。因此，有必要采取降低危害的针对性措施，包括规范饲养，减少运输污染，改善肉类屠宰加工卫生条件，提高消费者的食品安全意识，实施“从养殖场到餐桌”的全程质量管理体系，运用多重PCR检测方法长期监测动物性食品源空肠弯曲菌的发生及变化规律，可以有效控制和预防食源性空肠弯曲菌病发生，从而保证食品安全与人类健康。

图4 二重PCR检测部分鸡肉、牛肉样品中空肠弯曲杆菌电泳结果

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Development and Application of Multiplex PCR Assay for the Detection of Campylobacter jejuni in Animal Origin Food

Chen Xun，Zhong Xiao-li，Liu Shu-liang
(Cdlege of Food，Sichun Agricultural University，Ya’an 625014，China)

According to the 16S rDNA and hip O gene sequences of C.jejuni in GenBank，two pairs of specific primers were designed and used in multiplex PCR for detection of C.jejuni in animal origin food.Multiplex PCR was developed and applied to the sample testing.The results indicated that two specific fragments(699bp and 366bp)were detected after amplification of the DNA template of C.jejuni，while other bacteria strains(11 species tested)were not detected.Meanwhile，the 16S rDNA and hip O gene sequence of C.jejuni ATCC33560 exhibited a high similarity with those of some strains of C.jejuni presented in GenBank.The total assay could be completed in 27h with a detection limit of 2.4 ～16CFU/mL.The chicken，pork，beef and milk from Ya＇an markets in Sichuan province were detected by the multiplex PCR，and 38.0%，28.3%，17.1%and 8.6%of them were found respectively to be positive for C.jejuni.Multiplex PCR assay was specific，sensitive and time－ saving，which provided reference for detection of C.jejuni in animal origin food.

multiplex PCR，Campylobacter jejuni，animal origin food，detection

硕士研究生(刘书亮教授为通讯作者，E-mail:lsliang999@163.com)。

*“十一·五国家科技支撑计划”课题(2006BAK02A03-4)，公益性行业(农业)科研专项子课题(200903055)

2010－07－21，改回日期:2010－11－11