双孢蘑菇子实体多糖提取条件优化及部分特性研究*

乔德亮，陈乃富，张莉，陈科

1(皖西学院化学与生命科学系，安徽六安，237012)2(安徽仿生传感与检测技术省级实验室，安徽六安，237012)

双孢蘑菇子实体多糖提取条件优化及部分特性研究*

乔德亮1，2，陈乃富1，2，张莉1，2，陈科1，2

1(皖西学院化学与生命科学系，安徽六安，237012)2(安徽仿生传感与检测技术省级实验室，安徽六安，237012)

运 用热水浸提、乙醇沉淀、Sevag法脱蛋白、乙醇再沉淀的方法提取双孢蘑菇子实体多糖。在单因素(提取温度、提取时间、水料比及提取次数)实验基础上，运用4因素3水平的正交实验，对多糖的提取参数进行优化，优化得到的提取条件为:温度80℃、时间4 h、水料比50 mL/g、提取3次，该条件下多糖的提取率为3.5105%。苯酚-硫酸法测量粗多糖产品的多糖含量为71.84%。在10 mg/mL、25℃条件下，乌氏黏度计法测量粗多糖产品的相对黏度(相对于去离子水)为1.109 6。KBr压片法扫描了粗多糖的红外光谱，多糖的特征吸收峰(3 700～3 100 cm－1和3 000～2 800 cm－1)清晰可见。

双 孢蘑菇，多糖，提取，正交实验，特性

双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，中文别名为蘑菇、洋蘑菇、白蘑菇、双孢菇等，在欧美各国常被称之为普通栽培蘑菇(common cultivated mushroom)或纽扣蘑菇(button mushroom)。现代研究显示，双孢蘑菇富含蛋白质、多糖、维生素、核苷酸和不饱和脂肪酸等，它不仅营养丰富、味道鲜美，还具有抗肿瘤、抗突变、抗氧化、调节免疫等药理作用和保健功能［1－7］。

关于双孢蘑菇多糖，已有一些报道，如菌丝体多糖的化学结构［8］，子实体多糖的单糖组成［9］、抑制癌细胞作用［10］、抗菌作用［11］、抗氧化作用［12］，菌柄多糖的提取工艺优化［13］，但其子实体多糖的提取参数优化及一些理化性质未见报道。本课题在单因素实验的基础上，通过正交实验法对双孢蘑菇子实体多糖的提取参数进行优化，同时也报道了该多糖的部分特性。

1 材料与方法

1.1 实验材料、主要仪器设备与试剂

双孢蘑菇子实体购自安徽省守红农业科技开发有限公司，新鲜子实体切成小块状，60℃烘干、粉碎备用。

数显恒温水浴锅(HH-4型)，常州国华电器有限公司;电热鼓风干燥箱(101AS-2型)，上海浦东荣丰科学仪器有限公司;紫外可见分光光度计(SP-752型)，上海光谱仪器有限公司;乌氏黏度计，南京大展机电技术研究所;红外光谱仪(WQF-310型)，北京第二光学仪器厂。

葡萄糖标准品购于Sigma公司，其他试剂均为常规分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖提取

多糖的提取参照许泓瑜等［14］、张民等［15］报道的方法稍作修改。取干燥粉碎的材料加去离子水进行热水浸提(提取温度60～100℃，提取时间2～5 h，水料比10～50 mL/g，提取1～4次)。将浸提液离心(5 000 r/min，15 min)，取上清液，沉淀物用相同方法重新提取，重提液再离心(5 000 r/min，15 min)取上清液。合并上清液，置旋转蒸发器50℃减压浓缩至适量，浓缩液加3倍体积无水乙醇(乙醇终浓度为75%)沉淀过夜，离心(5 000 r/min，15 min)取沉淀物，得到水溶性粗提物。

粗提物采用Sevag法脱除游离蛋白。粗提物加适量水溶解，再加入1/5溶液体积的三氯甲烷-正丁醇(体积比5∶1)混合液，摇床剧烈振荡20～30 min，分液漏斗静置(20～30 min)使其分层，去除下层有机溶剂-蛋白相。上清液用相同方法反复脱蛋白若干次，直至分液漏斗内两液面间无蛋白层为止。最后将上清液置旋转蒸发器50℃减压浓缩至适量。浓缩液加9倍体积无水乙醇(乙醇终浓度为90%)沉淀过夜，离心(5 000 r/min，15 min)取沉淀物，沉淀物置60℃烘箱烘干，得粗多糖。

1.2.2 多糖含量、相对黏度测定

多糖含量的测定参照 Dubois等［16］、张惟杰［17］报道的苯酚-硫酸比色法稍作修改，以葡萄糖标准品为标样制作标准曲线。相对黏度的测定使用乌氏黏度计按照说明书进行，以去离子水作对照。测量条件为样品浓度10 mg/mL、温度25℃。

1.2.3 红外光谱分析

红外光谱分析参照孙元琳等［18］、Maciel等［19］报道的溴化钾压片法。使用傅立叶变换红外光谱仪，扫描范围为4 400 cm ～400 cm－1。

1.2.4 数据处理

单因素实验和正交实验时因素水平的确定均以多糖提取率为判断指标。多糖提取率的计算:

多糖提取率/%=［粗多糖中多糖质量(g)/原材料质量(g)］×100

粗多糖中多糖质量/g=粗多糖质量(g)×粗多糖中多糖含量百分比(%)

2 结果与分析

2.1 提取温度对双孢蘑菇多糖提取率的影响

提取温度设置60、70、80、90和100℃5个梯度，提取时间、水料比及提取次数分别为4 h、40 mL/g和3次，此时提取温度对双孢蘑菇多糖提取率的影响如图1所示。由图1可知，当提取温度在60～100℃范围内，随着温度升高多糖提取率逐渐增加，至90℃后再提高温度，多糖提取率开始逐渐下降，不过90℃与100℃的提取率差异不显著(P＞0.05)。有研究报道，温度升高可增加多糖的扩散系数和溶解性，有利于多糖从材料介质中进入提取溶剂内，从而可提高多糖的提取率。但温度过高，可能引起多糖链的水解，提取率反而下降［20－21］。本研究结果与其类似。

图1 提取温度对双孢蘑菇多糖提取率的影响

统计分析表明，60、70、80和90℃四者之间多糖提取率差异显著(P＜ 0.05)，60、70、80和100℃四者之间多糖提取率差异也显著(P＜0.05)，但90℃和100℃之间多糖提取率差异不显著(P＞0.05)。这些结果显示:当温度小于90℃时，提取温度对双孢蘑菇多糖提取率的影响呈正向显著性;当温度大于90℃时，提取温度对双孢蘑菇多糖提取率的影响不显著。所以为了节约能源和提取成本，90℃被选作后续正交实验提取温度的中心点。

2.2 提取时间对双孢蘑菇多糖提取率的影响

提取时间设置2、3、4和5 h 4个梯度，提取温度、水料比及提取次数分别是90℃、40 mL/g和3次，此时提取时间对双孢蘑菇多糖提取率的影响见图2。从图2可以看出，提取时间在2～5 h范围内，随着提取时间的延长，多糖提取率呈逐渐增加趋势。研究显示，提取时间是另一个影响提取率的主要因素，提取时间与多糖提取率呈正相关，即时间的延长可提高多糖的得率［14］。本研究结果与其基本一致。

图2 提取时间对双孢蘑菇多糖提取率的影响

统计分析表明，2、3和4 h三者之间多糖提取率差异显著(P＜0.05)，2、3和5 h三者之间多糖提取率差异也显著(P＜0.05)，但4 h和5 h之间多糖提取率差异不显著(P＞0.05)。这些结果显示:提取低于4 h时，提取时间对双孢蘑菇多糖提取率的影响呈正向显著性;超过4 h时，提取时间对双孢蘑菇多糖提取率的影响不显著。所以4 h被选作后续正交实验提取时间的中心点。

2.3 水料比对双孢蘑菇多糖提取率的影响

水料比设置10、20、30、40和50 mL/g五个梯度，提取温度、时间及提取次数分别是90℃、4 h和3次，此时水料比对双孢蘑菇多糖提取率的影响见图3。由图3可知，当水料比由10 mL/g增加到50 mL/g时，双孢蘑菇多糖的提取率呈逐渐增加趋势。张民等［15］报道水体积的增加有利于多糖物质的运输，从而可以提高多糖的提取率，但超过一定比例后影响并不显著。本研究结果与此类似。

统计分析表明，10、20、30和40 mL/g四者之间多糖提取率差异显著(P＜ 0.05)，10、20、30和 50 mL/g四者之间多糖提取率差异也显著(P＜0.05)，但40 mL/g和50 mL/g两者之间多糖提取率差异不显著(P＞0.05)。这些结果显示:当水料比小于40 mL/g时，水料比对双孢蘑菇多糖提取率的影响呈正向显著性;当水料比大于40 mL/g时，水料比对双孢蘑菇多糖提取率的影响不显著。考虑加水过多不利于后期的浓缩，所以40 mL/g被选作后续正交实验水料比的中心点。

2.4 提取次数对双孢蘑菇多糖提取率的影响

提取次数设置1、2、3和4次四个梯度，提取温度、时间及水料比分别是90℃、4 h和40 mL/g，此时提取次数对双孢蘑菇多糖提取率的影响如图4所示。从图4可以看出，随着提取次数的增加，双孢蘑菇多糖的提取率也逐渐增多，呈上升趋势。统计分析表明，1次、2次与3次三者之间多糖提取率差异显著(P＜0.05)，1次、2次与4次三者之间多糖提取率差异也显著(P＜0.05)，但3次与4次之间多糖提取率差异不显著(P＞0.05)。综合考虑产量和提取成本，3次被选作后续正交实验提取次数的中心点。

图3 水料比对双孢蘑菇多糖提取率的影响

图4 提取次数对双孢蘑菇多糖提取率的影响

2.5 正交实验优化双孢菇多糖的提取条件

在单因素实验的基础上，采用4因素3水平的正交实验，以多糖提取得率为指标，对双孢蘑菇多糖的提取条件进行优化。正交实验设计及结果列于表1。

表1 双孢蘑菇多糖提取条件优化的正交实验设计及结果

由表1中R的大小可知，提取次数对双孢蘑菇多糖的提取率影响最大，其次分别为提取时间、提取温度和水料比，即各因素的影响大小顺序为A ＞C＞D＞B。从表中均值大小可以看出，提取条件的最优组合为A2B3C2D1，而由表中实验值大小得出的最优组合为A2B1C2D3，两者结果不一致，因此需做验证性实验来验证。

取3份双孢蘑菇样品，以最优条件组合(A2B3C2D1)做验证实验，结果多糖的提取率为3.5105%，高于表中最优组合(A2B1C2D3)的实验结果(3.4318%)。因此，确定双孢蘑菇多糖提取条件的最优组合为A2B3C2D1，即提取次数3次、水料比50 mL/g、提取时间4 h、提取温度80℃。

2.6 双孢蘑菇粗多糖的多糖含量及相对黏度

苯酚-硫酸法测量双孢蘑菇粗多糖产品的多糖含量均值为71.84%。乌氏黏度计法测量双孢蘑菇粗多糖产品在10 mg/mL、25℃条件下的相对黏度(相对于去离子水)为1.1096。

2.7 双孢蘑菇粗多糖的红外光谱

KBr压片法扫描了双孢蘑菇粗多糖的红外光谱，结果如图5所示。3 700～3 100 cm－1处出现的宽而强的吸收带是羟基的O-H伸缩振动，3000～2800 cm－1处出现的强吸收峰是烷基的C－H伸缩振动，这两个吸收峰为多糖类物质的特征峰［17］，进一步证明这种物质是多糖类物质。1200～900 cm－1处出现的一组强吸收峰是糖环的醚键(C-O-C)的伸缩振动和羟基的O-H变角振动［17］。1700 ～1600 cm－1处出现的强吸收峰可能是羧基的C=O非对称伸缩振动，也可能是氨基的 N-H变角振动，还可能是水峰［17］，该吸收峰的具体归属有待于其他方法进一步确认。

图5 双孢蘑菇粗多糖的傅立叶变换红外光谱图

3 结论

双孢蘑菇多糖的最优提取条件为:提取温度80℃、提取时间4 h、水料比50 mL/g、提取次数3次。使用此条件，多糖的提取率为3.510 5%。双孢蘑菇粗多糖产品的多糖含量为71.84%。在10 mg/mL、25℃条件下，此粗多糖的相对黏度(相对于去离子水)为1.109 6。红外光谱扫描了双孢蘑菇粗多糖，多糖的特征吸收峰(3 700～3 100 cm－1和3 000～2 800 cm－1)清晰可见。

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Optimization of Extraction Parameters and Preliminary Feature of Polysaccharides from Sporocarp of Agaricus bisporus

Qiao De-liang1，2，Chen Nai-fu1，2，Zhang Li1，2，Chen Ke1，2
1(Department of Chemistry and Life Science，West Anhui University，Lu＇an 237012，China)2(Anhui Provincial Laboratory of Biomimetic Sensor and Detecting Technology，West Anhui University，Lu＇an 237012，China)

Polysaccharides from sporocarp of Agaricus bisporus was extracted by using methods of hot water lixiviation，ethanol precipitation，Sevag＇s deproteination and ethanol precipitation again.Extraction temperature，extraction time，ratio of water to raw material and extraction times were selected in single-factor tests.Based on the single-factor tests，combination of the extraction parameters was optimized by using four-factor-three-level orthogonal test.The optimum conditions were extracting temperature 80℃，extracting time 4 h，ratio of water to raw material 50 mL/g and extraction times 3.Practicing this optimal condition，extraction yield of polysaccharides from sporocarp of Agaricus bisporus was 3.510 5%.In crude polysaccharides of Agaricus bisporus sporocarp，carbohydrates content，determined by applying the phenol-sulfuric acid method，was 71.84%.Relative viscosity(to deionized water)，detected by using Ubbelohde viscosimeter，was 1.109 6 at temperature of 25℃ and concentration of 10 mg/mL.In FTIR spectrum obtained from KBr pellet method，characteristic absorptions(3 700～3 100 cm－1and 3 000～2 800 cm－1)of polysaccharides were observed clearly.

Agaricus bisporus，polysaccharides，extraction，orthogonal test，feature

博士，副教授。

*安徽省高等学校省级自然科学研究项目(KJ2010B256);六安市定向委托皖西学院市级研究重点项目(2009LWA003)。

2010－07－20，改回日期:2010－11－04