蚯蚓纤溶酶壳聚糖微球的制备及性质

武金霞,王英锐,田志鹏,李瑞,张贺迎

(1.河北大学生命科学学院,河北保定 071002;2.河北大学生物技术研究中心,河北保定 071002)

蚯蚓纤溶酶壳聚糖微球的制备及性质

武金霞1,王英锐1,田志鹏1,李瑞1,张贺迎2

(1.河北大学生命科学学院,河北保定 071002;2.河北大学生物技术研究中心,河北保定 071002)

以蚯蚓纤溶酶为生物大分子模式药物,研究壳聚糖载药微球的制备方法及对药物活性和稳定性的影响.以壳聚糖为原料,采用超声乳化交联法制备壳聚糖微球,分别吸附和包埋蚯蚓纤溶酶.在油水体积比15/1,搅拌转速800 r/min,1 m L戊二醛作为交联剂,超声处理5 min条件下乳化交联制备微球,包埋法具有较高的载药率和包封率,分别达到52.6%和48.7%,具有一定的缓释效果,在72 h药物累计释放率约为65%.用生理盐水溶出微球中的蚯蚓纤溶酶,电泳图谱显示,多数组分能被溶出,条带没有变化,在72 h内,包埋法活性总溶出率达51.5%.

蚯蚓纤溶酶;壳聚糖微球;载药率;包封率;溶出率

血栓病是严重危害人类健康的常见多发病,死亡率高,致残率高.当血栓发生后,最有效的治疗方法就是溶栓,近年来,以蚯蚓纤溶酶(earthwo rm fibrinolytic enzymes,EFEs)为主要活性成分的溶栓药在临床上发挥着重要作用,如百奥蚓激酶胶囊、普恩复胶囊等.EFEs是一组多组分的丝氨酸蛋白水解酶,其化学本质是蛋白质,不耐酸,多数组分不能耐受胃蛋白酶[1-3],目前EFEs剂型多为肠溶胶囊,虽能够有效避免胃液的破坏,但仍不能克服生物大分子药物生物利用度低的共有缺陷[4-5].

壳聚糖(chitosan,CS)是甲壳素脱乙酰基的产物,具有良好的生物降解性、生物相容性、生物黏附性和促进药物吸收的作用,可作为化学药物、多肽、蛋白质药物以及基因药物的载体,具有药物控释、组织靶向、提高药物稳定性等多方面优势,因而已成为近年来新型给药系统研究的热点[6-7].以小分子药物为模型的壳聚糖载药微球报道较多[8-9],壳聚糖载蛋白类药物微球的研究多以胰岛素和牛血清白蛋白为模式药物[10-11].但对EFEs壳聚糖微球的研究国外文献中未见报道,国内仅有陆一菱等尝试制备了蚓激酶壳聚糖亚微粒,比蚓激酶白蛋白纳米粒的载药量有所提高[12].研究EFEs壳聚糖微球,在溶栓类药物剂型改进上是一个新的尝试,可以提高EFEs稳定性,延长其有效时间,对扩大其临床应用具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 材料

壳聚糖(脱乙酰度99%,平均分子质量45 900),购自北京索来宝科技有限公司;司班80、体积分数为50%的戊二醛溶液(水合)、丙酮、液体石蜡、多聚磷酸钠(TPP)、异丙醇均为分析纯.蚯蚓纤溶酶冻干粉,购自天津贾立明蚯蚓养殖公司.

1.2 仪器

紫外可见分光光度计(北京普析通);冷冻离心机(Sigma公司);LGJ0-5冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂);水平摇床ZD-9556(太仓市科教器材厂);JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所).

1.3 方法

采用乳化交联法制备壳聚糖微球.以体积分数为1%的乙酸溶液为溶剂,配制20 g/L壳聚糖乙酸溶液,抽滤除去少量未溶解杂质.将司班80加入一定体积的液体石蜡中,使之占反应总体积的10%,搅拌15 m in,混合均匀.将10 mL壳聚糖乙酸溶液作为分散相加入到混合溶液中,继续搅拌,乳化均匀后超声波处理一定时间,加入一定体积戊二醛溶液,继续搅拌30 min.

反应物于6 000 r/min离心5 min,弃去上层油相.用石油醚洗涤离心沉淀物3次,每次3 000 r/min离心10 m in,弃上层有机溶剂.再用异丙醇脱水2次,每次3 000 r/min离心5 m in,弃上层有机溶剂.将产物自然干燥,即得壳聚糖微球.考察油水比、转速、戊二醛加量、超声处理时间对微球性能的影响.

包埋载药微球的制备,在形成油包水乳液之前将EFEs溶解在壳聚糖乙酸溶液中,其他同上.

吸附载药微球的制备,所得空白微球浸泡在EFEs溶液中24 h,6 000 r/min离心5 min,所得沉淀冷冻干燥.

1.4 微球载药率与包封率的计算

采用紫外吸收法测定EFEs浓度[13],Folin-酚法测定EFEs活力[14].载药率表示进入微球内部的药物占微球自身质量的百分比,包封率表示被包入微球的药物占药物总量的百分比.载药率=WC/WM×100%,包封率=WC/Wt×100%,其中WC为被包入微球的药物的质量,WM为微球质量,Wt为加入药物总质量.

1.5 蚯蚓纤溶酶体外释放实验

准确称量10 mg包埋有EFEs的湿微球,加入3 mL 0.1 mol/L PBS(p H 7.4)缓冲液,置于37℃恒温振荡器上振摇(120 r/min).间隔一定时间离心分离,取出0.5 mL上清液,同时补入0.5 m L新鲜PBS缓冲液,共累计溶出72 h.测定上清液中EFEs含量,计算累计释放率.

1.6 蚯蚓纤溶酶的稳定性实验

按1.5溶出EFEs,用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测EFEs条带的变化.

1.7 蚯蚓纤溶酶溶出活性保留率

按1.5溶出EFEs,Folin-酚法测定EFEs活力,以溶出总酶活占微球总载药酶活的百分比表示活性溶出率.

2 结果

2.1 油水体积比对乳化交联壳聚糖微球性能的影响

采用不同油水体积比分别制备壳聚糖微球,并对微球性能进行测定.结果见图1,图2.

由图1可以看出,包埋法的载药率和包封率都高于吸附法.油水体积比影响壳聚糖在乳化液中的分散及微球的内部结构.当油水体积比小于15/1时,微球载药率和包封率随油水比的增大而增加,油水体积比继续增大,微球载药率和包封率变化不大.

图2 油水体积比对包埋法载EFEs微球累计释放率的影响Fig.2 Effect of V(O)/V(W)on the release rate of m icrosphere encapsulated EFEs

由图2可以看出,包埋法制备的载药微球在释放初期前2 h内有突释现象,这是由于吸附在微球表面或以较弱的键与微球连接的药物在较短的时间内脱落造成.随后药物的释放具有缓释现象,油水体积比15/1和20/1所表现的缓释效果相似,在72 h累计释放率低于65%.综合考虑,以油水体积比15/1为宜.

2.2 转速对乳化交联壳聚糖微球性能的影响

转速对乳化交联壳聚糖微球性能的影响见图3,图4.

图3 不同转速对微球载药率和包封率的影响Fig.3 Effect of the rotate speed on the loaded rate and encapsulation efficiency of m icrosphere

由图3可以看出,随转速增加,载药率和包封率都有不同程度的增加,且包埋法较吸附法高.

图4 转速对包埋法载EFEs微球累计释放率的影响Fig.4 Release rate of m icrosphere encapsulated EFEs under different rotate rate

图4表明,增加转速可制备更小的微球,突释现象有一定改善,缓释效果更明显,72 h累计释放率低于65%,600,800 r/m in与1 000 r/m in的缓释曲线相似,综合考虑载药率和包封率,以800 r/min为宜.

2.3 戊二醛加入量对壳聚糖微球的影响

戊二醛作为常用的交联剂具有较好的交联效果,但是随加入量的增加,微球交联过密,硬度增大,并且微球之间容易粘连,造成载药量减小(图5).

从图6可知,戊二醛加量超过1.5 m L时,制得微球交联过密,硬度过大,在体外振荡释放条件下,EFEs较难从微球内部缓释出来,导致释放率过小.戊二醛加量低于0.5 mL时,微球机械强度差,易崩解,药物释放不符合缓释要求,戊二醛加量以1 m L为宜.

图5 戊二醛对微球载药率和包封率的影响Fig.5 Effect of glutaraldehyde on the loaded rate and encapsulation efficiency of m icrosphere

图6 不同戊二醛加量对包埋法载药微球药物累计释放率的影响Fig.6 Release rate of m icrosphere encapsulated EFEsat different glutaraldehyde concentration

2.4 超声处理对壳聚糖微球的影响

超声处理对壳聚糖微球的影响见图7,图8.

图7 超声处理时间对微球载药率和包封率的影响Fig.7 Effect of ultrason ic time on the loaded rate and encapsulation efficiency of m icrosphere

由图7可以看出,超声与否对微球载药率和包封率影响较大,但是超声时间长短对微球影响较小,以超声处理5 min为宜.

图8 不同超声时间下包埋法EFEs微球的累计释放率Fig.8 Release rate of m icrosphere encapsulated EFEs under different ultrasonic time

从图8可以看出,超声处理使得微球累计释放率变小,72 h药物累计释放率在60%左右,缓释能力增强.超声处理增强了液滴在液体石蜡中的分散性,制得的微球体积更小,比表面积更大,增大了微球的载药能力和缓释能力.

2.5 优化条件下制备载药微球的性能

在考察了油水体积比、转速、超声处理时间、戊二醛加量对微球性能的影响之后,在优化的条件下吸附法和包埋法制备EFEs壳聚糖微球,载药率和包封率均有所提高,包埋法的载药率和包封率分别达52.6%和48.7%,缓释效果没有明显变化.

2.6 蚯蚓纤溶酶的溶出稳定性及酶活保留率

以聚丙烯酰胺凝胶电泳检测从壳聚糖微球中溶出的蚯蚓纤溶酶,结果见图9.

图9 微球溶出的蚯蚓纤溶酶电泳Fig.9 EFEs released from m icrosphere

从图9可知,EFEs原液为含有多个组分的混合物,经过制备壳聚糖载药微球和重新溶出,多数主要条带能从微球中溶出,溶出量随溶出时间延长而增多,并未由于制备载药微球而被破坏,可见本研究采用的方法能维持酶类药物稳定.包埋法微球中,溶出后酶液条带较浅,是由于包埋法具有较强的缓释效果,在一定时间内,溶出的 EFEs质量较少.

收集溶出72 h的酶液,冷冻干燥,测定酶活力与比活力,计算溶出率,结果见表1.

表1 不同方法制备载药微球的药物溶出率Tab.1 EFEs dissolving rate from m icrospheremade by differentmethods

由表1可知,2种方法制备的微球均具有较高的药物溶出率,吸附法略高于包埋法,这是由于包埋法微球具有更好的缓释性能,在72 h内溶出药物总质量略少.

3 讨论

本研究发现,超声处理和搅拌转速是影响壳聚糖载药微球性能的主要因素.超声处理可以使液滴进一步细化,制备的微球体积更小,比表面积更大,增大了微球的载药能力和缓释性能,但超声处理的时间对微球性能影响不大,说明一定的超声处理时间就能起到细化微滴的作用.较高的搅拌转速也有利于形成粒径较小分布较集中的微球.

吸附和包埋法载药微球均有较好的缓释效果.在前2 h内有突释现象,突释可以在给药后短时间内达到较高的血药浓度.随后药物的释放变得缓慢,是由于壳聚糖微球吸水后溶胀,微球的微孔孔径缩小或消失,药物只能通过微球骨架缓慢扩散,另外,微球内外药物浓度差逐渐减小也可造成后期释放缓慢.

本实验制备的EFEs壳聚糖微球在生理盐水中具有较高的稳定性和溶出率,但在模拟胃液及小肠液的环境下的溶出率及稳定性有待进一步研究.

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Preparation of Chitosan M icrosphere Loaded Earthworm Fibrinolytic Enzymesand Its Properties

WU Jin-xia1,WANG Ying-rui1,TIAN Zhi-peng1,LIRui1,ZHANG He-ying2
(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;2.Research Center for Biotechnology,Hebei University,Baoding 071002,China)

To study the p reparingmethodsof chitasonmicrospheresand investigate the influence in drug activity and stability when earthworm fibrinolytic enzymes(EFEs)wasas biomacromoleculemodel drug.The chitosan microsphereswere p repared by ultrasonic emulsification method,EFEswas encapsulated and adsorbed into microspheres respectively.Theoptimized factorswere as follow s.V(O)/V(W)was15/1,stirring speed was800 r/min,adding 1 mL of glutaraldehyde,ultrasonic treatment for 5 min.The loaded rate and encapsulation efficiency of the microsphere encapsulated EFEsat these conditionswere 52.6%and 48.7%respectively,themicrosphere pocessed the sustained releasing p roperty,the total releasing rate in 72 hours were about 65%.Physiological saline was used to dissolve the EFEs from microsphere,the photogram of PAGE indicated thatmostof the EFEs components could be dissolved,and no obvious changes could beobserved.The dissolved EFEsactivity was determined by Folin-phenolmethod,the results showed that the total dissolution rate of themicrosphere encapsulated EFEswas 51.5%w hen dipped in physiological saline for 72 hours.

earthworm fibrinolytic enzyme;chitosan microsphere;drug loaded rate;encapsulation efficiency;dissolution rate

Q 55

A

1000-1565(2011)04-0406-07

2011-04-12

河北大学博士基金资助项目

武金霞(1966-),女,河北曲阳人,河北大学教授,博士,主要从事生物化学及基因工程药物研究.

E-mail：w jx6@163.com

赵藏赏)