3-氨基苯硼酸纸片法检测大肠埃希菌高产AmpC酶的探讨*

李 静 胡志东 田 彬 徐海茹 李 金

AmpC酶又称诱导酶，属于Bush分类中的Ⅰ类酶及分子生物学中的C类酶[1]。AmpC酶多数由染色体介导，部分呈诱导型表达。近年也陆续发现了质粒介导AmpC酶，其耐药基因可在同种或不同种属细菌间广泛传播，使细菌耐药日趋复杂，给临床治疗提出了严峻的挑战，迫切需要临床实验室能快速而准确地检测产AmpC酶的细菌。目前临床实验室标准化委员会（CLSI）尚未确定检测的标准方法，本研究以三维试验和聚合酶链反应（PCR）为参照，与3-氨基苯硼酸（APB）双纸片协同法进行比较，以评价APB双纸片协同法用于临床实验室检测临床分离的大肠埃希菌的可靠性。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2010年1月—10月天津医科大学总医院住院患者各类送检标本（包括痰、尿、血、胸水、腹水等），经常规方法进行细菌分离，用Compact全自动微生物分析仪鉴定，选取无重复分离大肠埃希菌44株进行研究。大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603购自卫生部临检中心。阴沟肠杆菌O29M（染色体介导，AmpC酶持续高产株）、ACT-1质粒介导AmpC酶大肠埃希菌由北京协和医院检验科惠赠。

1.2 主要试剂与仪器 头孢西丁（FOX，30 μg）、头孢他啶（CAZ，30 μg）、头孢噻肟（CTX，30 μg）购自北京天坛药物生物技术开发公司，水解酪蛋白（MH）琼脂粉购自上海伊华医学科技有限公司，APB干粉购自Sigma公司。DNA Marker、PCR扩增试剂购于北京全式金生物技术有限公司，VITEK-2 compact全自动微生物系统及鉴定卡、药敏试验卡购自法国生物梅里埃公司，9700型DNA扩增仪为美国Perkin Elmer公司产品，Gel Doc 2000凝胶成像系统仪为美国Bio-Rad公司产品，水平电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 APB纸片制备方法 以二甲基亚砜作为溶剂，配成60 g/L的APB溶液，取5 μL上述APB溶液分别加入到直径为6 mm，吸水量为20 μL的无菌空白滤纸上，使每片测试纸片上含有APB 300 μg，待纸片干燥后，至2℃～8℃下保存备用。

1.3.2 APB双纸片协同试验 参照文献[2]方法，将待测菌株配成0.5麦氏单位的菌液，均匀涂布MH平板，稍干后中央贴APB纸片，在距中央12 mm的位置贴上CAZ、CTX纸片，35℃过夜培养，以APB与任何一种头孢菌素产生协同为阳性，见图1。

1.3.3 三维试验 参照文献[3]进行，以阴沟肠杆菌O29M作为产AmpC酶的阳性对照,以肺炎克雷伯菌ATCC 700603为阴性对照。（1）粗提酶液制备（冻融裂解法）：将质控菌和待检菌密涂于1/4MH琼脂平板（平板直径为90 mm）上，35℃孵箱培养24 h后，用灭菌棉棒取下全部菌苔于1 mL灭菌生理盐水中（用1.5 mL离心管），置-70℃低温冰箱反复冻融5次。然后，在4℃条件下，10 000 r/min离心15 min，抽取上清液即为粗提酶液。（2）三维试验：将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC 25922菌液均匀涂布于MH平板上，取FOX纸片（30 μg/片）置于平板中央，使用刀片在离纸片边缘5 mm处放射状由里向外切割一道狭缝，用微量加样器取30 μL酶粗提液由里向外加入狭缝内，酶液切勿溢出狭缝，将MH平板放入35℃孵箱过夜。若狭缝与抑菌圈处出现扩大的长菌区，则视为三维试验阳性，见图1。

1.3.4 DNA模板的制备 采用煮沸法。将菌株接种在MH平板上孵育18～24 h后，选取数个菌落至1.5 mL离心管中，加入灭菌双蒸水150 μL，煮沸10 min后立即放冰上冷却，于4℃12 000 r/min离心10 min，取上清液作为PCR反应模板立即使用，或-20℃保存备用。

1.3.5 PCR检测AmpC酶基因 参照文献[4]委托上海Sangon公司合成6对AmpC酶基因引物，见表1。PCR反应体系（25 μL）：dNTP2 μL、引物各0.5 μL、模板0.5 μL、Taq酶0.25 μL、10×PCR缓冲液2.5 μL、去离子水18.75 μL。PCR条件：94 ℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 1 min，30个循环后72℃延伸7 min。反应结束后取5 μL PCR产物经含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果，用凝胶成像系统照相保存。

表1 PCR引物序列

1.4 统计学处理 采用配对χ2检验进行各组率的比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

APB双纸片协同试验、三维试验、PCR法检测结果的阳性率分别为70.5%、56.8%和75.0%。APB双纸片协同试验与三维试验的阳性符合率为88.0%，阴性符合率为52.6%，总符合率为72.7%，2种检测方法结果差异无统计学意义，见表2。以PCR结果为金标准,APB双纸片协同试验的灵敏度为90.1%，特异度为90.1%，符合率为90.1%，2种检测方法结果差异无统计学意义，见表2。

表2 APB双纸片协同试验与三维试验及PCR法比较结果 （株）

3 讨论

产AmpC酶的致病菌因对多种抗生素耐药，给临床抗感染治疗造成了很大的困难，高效的检测方法能协助临床合理用药。AmpC酶是革兰阴性菌产生的临床上最重要的β-内酰胺酶之一，能对第3代头孢菌素、单环类、头霉素类等β-内酰胺类抗生素耐药，其比超广谱β-内酰胺酶具有更宽的底物谱且对酶抑制剂不敏感，已受到广泛的重视[5]。大肠埃希菌是临床上最常见的革兰阴性杆菌病原菌，可以由染色体突变或质粒介导持续高产AmpC酶。

目前，AmpC酶检测尚无统一标准，临床实验室检测AmpC酶存在很多困难。国内外已报道了多种检测AmpC酶的方法，但至今仍未建立起一种筛选和发现AmpC酶的标准的表型检测方法[6]。三维试验是目前公认的质粒AmpC酶或持续高产AmpC酶的经典检测方法，其不受抗生素的诱导作用，准确率较高，结果清晰、易判读；但三维试验操作非常繁琐且费时，另外，酶的种类以及提取酶的量影响对头孢西丁活性的水解，因而难在一般实验室常规使用。分子生物学检测技术虽然能获得准确的检测结果，但操作复杂、费时、成本高，也无法用于常规检验。国内学者沈定霞等[7]提出用APB纸片增强试验检测高产AmpC酶和质粒AmpC酶；日本学者Yagi等[2]提出应用APB双纸片协同试验和增效试验检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌高产AmpC酶菌株；本研究采用Yagi等[2]提出的APB双纸片协同试验检测大肠埃希菌高产AmpC酶，主要利用APB是AmpC酶抑制剂的原理设计，头孢他啶和头孢噻肟在靠近APB一侧对细菌的抑菌圈直径有扩大来推测该细菌高产AmpC酶[8]。

本研究显示，APB纸片法、三维试验和PCR法分别对44株大肠埃希菌进行AmpC酶检测阳性率分别为70.5%、56.8%、75.0%，高于冯福英等[9]报道的16.7%，这可能与不同地区用药特点、用药水平、所选菌株及菌株数量等有关。三维试验检测阳性的25株菌中22株APB法也阳性，2种方法的阳性符合率为88.0%，3株APB法为阴性，分析其原因可能为：（1）菌株产酶量少，APB法没有破坏细菌菌体使其释放β-内酰胺酶，因而无法检测到。（2）产AmpC酶菌株作用底物为头孢他啶和头孢噻肟以外的底物，造成APB法漏检；9株APB法检测为阳性的菌株，而三维试验检测为阴性，可能因为APB法存在部分假阳性菌株。PCR法检测阳性的33株菌中，其中30株APB法也阳性，APB法的灵敏度为90.1%，特异度为90.1%，3株APB法为阴性，可能因为菌株产酶量少而无法检测到，但也不排除APB法漏检的可能性；1株APB法检测为阳性的菌株，而PCR法检测为阴性，分析其原因可能为：（1）部分菌株为高产AmpC酶菌株，PCR法检测不到。（2）有部分菌株虽然是质粒AmpC酶菌株，可能携带基因为本文所检测的6对引物扩增范围以外的基因，导致PCR检测不到。（3）APB法可能产生部分假阳性菌株。另外，本试验过程中使用含300 μg APB纸片协同法检测细菌产生的AmpC酶，操作简便、快捷、经济、实验结果明确且易于判定，可供参考使用。

致谢：本研究中APB纸片制备部分得到天津金斯坦生物科技有限公司的大力支持和帮助。

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