N5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与宁夏回族原发性高血压的关系*

刘海燕 陈淑萍 马 萍 徐清斌

原发性高血压（essential hypertension，EH）是影响人类健康最常见的心血管疾病，是由遗传和环境因素共同作用而引起的多基因遗传病。近年来,高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血症被认为是心血管疾病的危险因素，并且可能参与了高血压的病理生理过程[1]。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy代谢的关键酶，MTHFR基因677碱基C/T突变，产生MTHFR酶的不耐热性变化，导致酶活性下降，使血浆Hcy水平升高及DNA低甲基化[2],从而产生一系列的病理变化。因此，MTHFR基因突变与高血压的关系成为研究的热点之一。虽然国内外开展了一些MTHFR基因多态性与高血压发生的关联性分析，但结论尚不一致，而且对少数民族人群的研究还很少，特别是对我国西北地区相对聚居的宁夏回族高血压人群易感性的相关性研究更少见报道。本研究旨在探讨宁夏回族人群MTHFR基因C677T多态性与EH的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选自2009年12月—2010年10月在宁夏医科大学附属医院门诊体检者及住院的、长期居住于宁夏的回族患者（相互间无血缘关系、三代血亲无异族通婚）。高血压组（EH组）146例，男74例，女72例，平均年龄（48.28±16.03）岁。入选标准：符合2005年WHO/lSH高血压治疗指南分类标准：收缩压≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和（或）舒张压≥90 mm Hg者，既往确诊的高血压患者或在2周内服用过降压药者；排除肝、肾、甲状腺、糖尿病等疾病和药物等引起继发性高血压的患者。对照组（NT组）112例，男63例，女49例，平均年龄（45.1±16.16）岁。入选标准：收缩压<140 mm Hg，舒张压<90 mm Hg，无服用降压药史，无高血压病家族史，排除肝、肾、甲状腺疾病及糖尿病等。

1.2 方法

1.2.1 一般临床资料的收集 收集性别、年龄，测量心率、身高、体质量，并计算体质量指数（BMI），BMI=体质量/身高2（kg/m2）。

1.2.2 生化指标检测 清晨空腹12 h抽外周静脉血10 mL，5 mL行生化检查，采用Olypuse公司2700型全自动生化分析仪检测空腹血糖（GLU）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、血尿酸（UA）、尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）。另外5 mL静脉血EDTA-Na抗凝，-70℃冰箱保存备用，用于基因组DNA的提取。

1.2.3 外周血白细胞抽提DNA 使用血液基因组DNA小量抽提试剂盒提取基因组DNA，试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.4 PCR扩增及检测 （1）PCR扩增：引物设计使用Primer3InPut网络软件，上游引物为5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGC GGGA-3′，下游引物为5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′。反应体系 20 μL，10×buffer（Mg2+）2 μL，4 种脱氧核苷酸（dNTP，2.5 mmol/L）1.6 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，DNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 14.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30～35次，72℃延伸10 min。（2）酶切及电泳：对PCR扩增产物理想的样品进行酶切分析。10 μL酶切体系包括PCR产物3 μL，HinfI内切酶 0.2 μL，10×buffer 1 μL，ddH2O 5.7 μL，BSA 0.1 μL，37℃水浴过夜。酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳（溴化乙啶染色），室温下恒压100 V电泳30 min后取出凝胶，在凝胶成像仪中观察基因诊断结果。

1.2.5 聚合酶链反应-限制性片段长度（PCR-RFLP）多态性技术检测 MTHFR基因677位原有的C为T代替，产生HinfⅠ限制性内切酶酶切位点。本组PCR扩增产物经酶消化，产生3种基因型:野生型（C/C型）仅见198 bp片段；纯合突变型（T/T型），酶切后产生175 bp和23 bp 2个片段，凝胶显示175 bp 1条带（后者已泳动至胶外）；杂合突变型（C/T型），既有198 bp片段，又有175 bp和23 bp片段，凝胶上显示198 bp和175 bp 2条电泳带，见图1。资料用±s表示，组间均数比较做t检验，方差不齐采用近似t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较以及组间人群基因分布Hardy-Weinberg平衡检验用χ2检验。二元逐步Logistic回归分析基因型与高血压病易感性的关联关系。检验水准双侧α=0.05。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 EH组和NT组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（EH组χ2=4.456 3，NT组χ2=2.155 1，P>0.05），表明研究对象来自同一群体，具有较好的代表性。

2.2 EH组和NT组一般临床资料比较 2组收缩压、舒张压、脉压、平均动脉压、BMI、BUN、Cr、GLU、TG和心率差异有统计学意义（P<0.05），其中EH组除了GLU和心率较NT组低外，其余各指标均高于NT组，其他各项2组间比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表l。

2.3 2组MTHFR基因型及等位基因比较 2组CC、CT和TT这3种基因型总体分布频率差异有统计学意义（P<0.05），EH组TT基因型高于NT组。EH组T等位基因频率高于NT组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4 不同MTHFR基因型间血压水平比较 CT+TT基因型组和CC基因型组在舒张压上差异无统计学意义（P>0.05），但CT+TT型组的收缩压、脉压和平均动脉压高于CC基因型组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表1 EH组与NT组一般资料比较

表2 回族高血压组与非高血压组基因型及等位基因分布比较 例（%）

表3 不同基因型间血压水平的比较 （mm Hg，±s）

表3 不同基因型间血压水平的比较 （mm Hg，±s）

基因型CC型CT+TT型t n 115 143收缩压131.83±20.52 139.27±21.22 2.837*舒张压82.95±12.67 85.93±13.22 1.835脉压48.89±13.99 53.34±14.3 2.508*平均动脉压99.24±14.28 103.71±14.87 2.440*

2.5 Logistic回归分析 以是否患有高血压（0：否，1：是）为应变量，将基因型（CC型：0，CT+TT型：1）、性别（男：0，女：1）、年龄、BMI、GLU、UA、BUN、Cr、TC、TG、HDL-C、LDL-C、高血压家族史（无：0，有：1）引入模型。采用逐步Logistic回归分析结果显示：CT+TT基因型、女性，BMI、TG、BUN增高为EH的危险因素，GLU为保护因素，见表4。

3 讨论

EH作为多基因病的特征之一就是具有种族差异。回族是我国具有代表性的少数民族之一，他们的生活条件、饮食构成、地理环境以及宗教信仰等都可产生一定的制约性，有时甚至可以起到决定性作用[3]。宁夏是我国回族聚居的主要地区之一，由于回族禁止与非信仰伊斯兰教的民族间通婚，因此形成了遗传上相对的“隔离群体”，是独特的人类遗传资源[4]。EH在我国西北地区发病率较高，对宁夏回族人群进行遗传多态性研究，可为回族人群的群体遗传学研究提供理论依据，也为研究我国不同人群EH发病的遗传机制和预防、治疗回族高血压起指导作用。

表4 多因素Logistic回归分析结果

Hcy是一种血管损伤性氨基酸。有研究认为高Hcy血症是心血管病的危险因素，血浆Hcy水平升高可以损伤血管内皮细胞，使内皮素-1合成增加,一氧化氮及前列环素分泌减少，破坏血管舒、缩因子的平衡[5]。另外高Hcy还可刺激血管平滑肌细胞增殖，引起内皮下水肿及纤维组织积聚，与高血压的发病密切相关[6]。因此Hcy水平的升高可能参与了EH的病理生理过程。而MTHFR是影响Hcy代谢的关键酶，MTHFR基因第677位点上C→T的突变被认为是引起高Hcy血症的主要原因之一。因此,MTHFR基因成为高血压研究的候选基因，其突变与血压值的关系引起了研究者的重视。

以往关于MTHFR基因C677T位点多态性与EH的关系研究结果报道不一。Lwin等[7]在研究日本男性MTHFR基因C677T多态性与高血压和高尿酸血症时，发现MTHFR基因C677T多态性与高血压无关。Tylicki等[8]认为基因型频率在EH和健康人群中的分布没有差异，即此基因多态性与EH无关。然而，Golledge等[9]对土耳其人研究发现MTHFR基因C677T多态性是高血压的独立危险因素。邢绣荣等[10]研究发现MTHFR基因C677T多态性可能是北京城区汉族人群发生高血压的危险因素。本研究结果显示EH组MTHFR基因C677T位点变异型纯合子TT频率及T等位基因频率均高于NT组。CT+TT基因型组的收缩压、脉压和平均动脉压均高于CC基因型组。CT+TT基因型为EH的危险因素。由此得出，MTHFR基因C677T多态性可能与宁夏回族EH发病有关，携带MTHFR基因677位点变异体的人群患EH的危险性增加，T等位基因可能是宁夏回族人群EH的易感基因。本研究结果显示GLU为EH的保护因子，可能是由于EH组大多选自住院患者，而NT组均来自门诊健康体检者，采血时由于活动、情绪应激等状态不同，使得NT组GLU平均水平略高于EH组，实际上两组入选者都是排除糖尿病的，故仍不能否认糖尿病是EH的危险因素。以上研究结果的不同，可能是血压水平受基因因素和环境因素的共同影响。不同种族、人群的遗传背景差异很大，基因多态性位点的作用强度不同，以及饮食习惯、居住环境、疾病、样本量大小、统计方法选择等都可能影响研究的结果，导致不同研究之间存在差异。

总之，EH是一种多基因复杂疾病，对于MTHFR基因多态性、基因-环境、基因-基因之间的相互作用对EH的确切影响还有待于研究者在样本量、样本构成、研究方法、人种及地理差异等方面进行进一步的综合分析。

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