葡萄籽原花青素对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响

周 恒, 林焕冰,卓烨烨,毕炳添,李国熊,徐江平

(1．南方医科大学药学院神经药理学科，广东 广州 510515；2．广东省食品药品监督管理局审评认证中心，广东 广州 510080)

葡萄籽原花青素对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响

周 恒1, 林焕冰2,卓烨烨1,毕炳添1,李国熊1,徐江平1

(1．南方医科大学药学院神经药理学科，广东 广州 510515；2．广东省食品药品监督管理局审评认证中心，广东 广州 510080)

目的观察葡萄籽原花青素(GSP)对血管性痴呆(VD)大鼠空间学习记忆能力的影响，探讨其可能的作用机制。方法采用改良Pulsinelli四血管阻塞法建立VD大鼠模型，造模成功后，每天灌胃给药，Wistar大鼠分为假手术组，模型组，原花青素组(50 mg/kg和150 mg/kg)，银杏叶片24 mg/kg。Morris水迷宫检测VD大鼠空间学习记忆能力；比色法检测脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量；实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测海马Bax、Bcl-2 mRNA的表达。结果与模型组比较，原花青素可明显改善VD大鼠空间学习记忆能力；提高脑组织SOD活性、GSH含量和总抗氧化能力，降低MDA含量；提高海马Bcl-2/Bax mRNA比值。结论原花青素可改善VD大鼠学习记忆功能，其机制可能与提高机体抗氧化能力、抑制海马神经元凋亡有关。

原花青素；血管性痴呆；氧化应激 ；凋亡

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能障碍综合征。我国65岁以上老年人的血管性痴呆患病率约为1.1%[1]，随着人口老龄化的加剧和卒中治疗死亡率的降低，血管性痴呆的患病率持续上升，寻找有效的治疗药物已成为研究的热点。

葡萄籽原花青素有着极强的抗氧化及清除活性自由基能力，其保护心血管、防治癌症、抗炎、抗辐射、提高学习记忆等药理作用一直受到研究重视[2]。之前的研究显示，原花青素有抗小鼠血管性痴呆的作用[3]，能抵抗因H2O2氧化损伤导致的细胞凋亡[4]。本研究就葡萄籽原花青素对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响进行研究，并探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1药品与材料 原花青素(葡萄籽提取物，上海康九化工有限公司，原花青素低聚体含量≧95%)；银杏叶提取物(上海杏林科技药业股份有限公司，批号080908)；超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、丙二醛、还原型谷胱甘肽试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号 20091111)；TRIzol(Invitrogen)、PrimeScriptTMRT逆转录试剂、SYBR Premix EX TaqTM(TaKaRa), Biometra Tgradient PCR仪，Stratagene Mx3000P 荧光定量PCR仪，Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)。

1.2动物分组 Wistar大鼠50只，雄性，220～250 g，许可证号SCXK粤2006-0015，随机分为假手术组，模型组，原花青素低剂量组50 mg/kg，原花青素高剂量组150 mg/kg，银杏叶片组24 mg/kg，动物自由觅食饮水，自然光照。

1.3方法 采用改良Pulsinelli四血管阻塞法制作VD模型[5]。动物用10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，颈正中切口并分离两侧颈总动脉，置4号丝线备用。暴露第一颈椎两侧翼孔，用直径0.5 mm的电凝针灼烧两侧翼孔内的椎动脉，使椎动脉闭塞。术后24 h，在动物清醒状态下将其固定，两侧颈总动脉分别用无创性小动脉夹夹住，造成全脑缺血。模型成功标准为：夹闭1 min后翻正反射消失，动物僵直无反应，毛发竖立，眼发白。缺血10 min后，松开动脉夹，缝合后回笼饲养。假手术组仅暴露双侧颈总动脉和翼孔，不作缺血处理。取造模成功的大鼠每天灌胃给药，给药体积为1 ml/100 g，药物用1%CMCNa配置成混悬液，假手术组和模型组给予1%CMCNa溶液。

1.4Morris水迷宫实验 术后第15天给药30 min后开始Morris水迷宫测试[6]，训练时将大鼠面向池壁放入水中，待大鼠找到平台之后，让其在平台上停留10 s，如果大鼠在90 s内未找到平台，将其引至平台停留10 s，每天3个位点入水，连续训练5 d。第6天撤去平台进行空间探索实验，记录大鼠90 s内穿越原平台的次数和在原平台所在象限的游泳时间。

1.5脑组织SOD活性、MDA、GSH含量和T-AOC变化 实验结束后大鼠麻醉处死，按试剂盒方法进行操作，检测全脑SOD活性、MDA、GSH含量及T-AOC，考马斯亮蓝法标定蛋白含量。

1.6Real-time PCR检测海马Bax、Bcl-2 mRNA表达 采用简单随机法，抽取4只大鼠海马，按TRIzol抽提试剂盒说明书提取RNA。按PrimeScriptTM RT试剂盒操作合成cDNA。β-actin引物序列AGAGGGAAATCGTGCGTGAC/CCATACCCAGGAAGGAAGGCT，产物长度195 bp，Bax 引物序列GGCCCACCAGCTCTGAACAG/GCAATCATCCTCTGCAGCTCCATATTA，产物长度为208 bp，Bcl-2引物序列TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC/TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC，产物长度119bp 。实验独立重复3次。根据Mx 3 000 P提供的CT值，△CT = CTGene- CTβ-actin,△△CT = △CTtreated- △CTcontrol,通过相对定量法(2-△△CT),计算各基因mRNA表达水平,并计算各组与假手术组的比值。

2 结果

2.1原花青素对血管性痴呆大鼠空间学习记忆的影响 表1结果显示，与假手术组相比，VD大鼠出现明显的空间学习记忆障碍，表现为逃避潜伏期明显延长，撤去平台后的空间探索实验中，穿越平台次数和在原平台象限游泳时间占总游泳时间的百分比明显降低(P<0.01)。原花青素(50和100 mg/kg)能明显缩短大鼠的逃避潜伏期，增加穿台次数和大鼠在原平台所在象限的游泳时间占总游泳时间的百分比，表明原花青素能明显改善血管性痴呆大鼠的空间学习记忆功能(P<0.05或P<0.01)。

表1 原花青素对VD大鼠空间学习记忆能力的影响

注：1)P<0.05,2)P<0.01,与模型组比较。

2.2原花青素对血管性痴呆大鼠抗氧化能力的影响 由表2数据可以看出，与假手术组相比，VD大鼠脑组织GSH含量降低、SOD活性降低、T-AOC降低、MDA含量升高(P<0.01)。原花青素(50和150 mg/kg)均可提高血管性痴呆大鼠脑组织GSH含量、SOD活性和总抗氧化能力，降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)。

2.3原花青素对血管性痴呆大鼠海马Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响 由表3数据可知，与假手术组相比，VD大鼠海马Bax mRNA表达上调，Bcl-2 mRNA表达下调(P<0.01)。原花青素(50和150 mg/kg)可下调血管性痴呆大鼠海马Bax mRNA表达(P<0.05或P<0.01)，上调Bcl-2 mRNA表达(P<0.01)，使Bcl-2/Bax mRNA表达的值显著上升(P<0.01)。

表2 原花青素对VD大鼠脑组织GSH、SOD、MDA、T-AOC的影响

注：1)P<0.05,2)P<0.01,与模型组比较。

表3 原花青素对VD大鼠海马Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响

注：1)P<0.05,2)P<0.01,与模型组比较。

3 讨论

理想的VD动物模型应与临床VD人脑的病理损害相一致，且伴有动物智能损害，本研究采用的Pulsinelli四血管阻塞法是目前较为公认的VD造模方式，它可高度模拟VD的发病特点。Morris水迷宫实验能够检测动物的认知能力，被广泛应用于动物学习记忆的研究[7]。本研究中，笔者发现VD大鼠与假手术组相比，逃避潜伏期明显延长；空间探索实验中，VD大鼠穿越平台的次数和平台所在象限探索时间占总游泳时间的百分比较假手术组都明显减少，显示VD大鼠学习记忆能力的下降。与模型组相比，原花青素能显著改善VD大鼠的学习记忆能力。

原花青素能够清除自由基，提高机体的抗氧化能力，其自由基清除作用可能为广谱的抗自由基能力[8]。SOD活性可以间接反映清除自由基的能力，MDA的含量可以反映脂质过氧化的程度，提示自由基对机体的损伤程度。GSH能清除自由基，稳定巯基酶，减轻过氧化对机体的损害，GSH含量也能衡量机体的抗氧化能力。T-AOC代表体内酶性和非酶性抗氧化物的总体水平，可综合反映组织对抗自由基对脂质膜的损害和清除活性氧的能力。与假手术组相比，VD大鼠脑组织SOD活性、GSH含量和T-AOC明显降低，MDA含量明显升高，提示氧化抗氧化系统稳态失去平衡。原花青素可提高脑组织SOD活性、GSH含量，缓解T-AOC降低，减少MDA的生成，改善自由基代谢表现出抗氧化作用,其作用机制与银杏叶提取物类似[9]。

大脑缺血缺氧是VD的重要病因，海马是缺血性脑损伤最敏感的脑区之一。VD患者海马CA1区神经元明显减少，弥散性或局灶性脑缺血引起海马神经细胞坏死与凋亡是其主要因素[10]。Bcl-2家族蛋白调控着线粒体结构与功能的稳定性，发挥着细胞凋亡的主开关作用[11]。Bcl-2基因表达的Bcl-2蛋白是定位在内膜系统上包括线粒体膜上的一种凋亡调控蛋白，可以与线粒体膜上的电压依赖性阳离子通道结合来调节促凋亡因子细胞色素C的释放，也可以和Bax蛋白结合，阻断其插入到线粒体膜上来维持线粒体的膜电位，具有抑制细胞凋亡的作用，而Bax具有促细胞凋亡的作用，Bcl-2/Bax值决定细胞接受凋亡刺激信号后的存活状态[12]。与假手术组相比，VD大鼠海马Bcl-2 mRNA表达显著降低，Bax mRNA表达升高，原花青素可上调Bcl-2 mRNA表达，下调Bax mRNA表达，使Bcl-2/Bax比值明显高于模型组，提示原花青素具有抗凋亡作用，后期神经元凋亡可能少于模型组，但还需Bax和Bcl-2等凋亡相关蛋白的蛋白水平测定确证。此外，脑组织内抗氧化与抗凋亡之间的联系也有待进一步研究。

本研究发现，原花青素可改善VD大鼠学习记忆功能，其机制可能与提高机体抗氧化能力、抑制海马神经元凋亡有关，这为原花青素作为血管性痴呆治疗药物提供了新的实验依据。

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2011-01-07

[修回日期] 2011-03-13

Effectsofgrapeseedprocyanidinsonspatiallearningandmemoryinvasculardementiamodelofrats

ZHOU Heng1，LIN Huan-bing2，ZHUO Ye-ye1，Bi Bing-tian1，Li Guo-xiong1，XU Jiang-ping1

(1．Department of Neuropsychopharmacology, School of Pharmacy, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China；2．Center for evaluation & certification, Guangdong food and drug administration, Guangzhou 510080, China)

ObjectiveTo investigate the effects and possible mechanisms of procyanidins, a polyphenol extracted from grape seeds, on spatial learning and memory in rats model of vascular dementia(VD).MethodsModified Pulsinelli's 4-vessel occlusion (4-VO) method was used for replicating vascular dementia in rats. The male Wistar rats were divided equally into 5 experimental groups: in one the rats were subjected to sham-operated, and in the other four the rats was subjected to the 4-VO surgery followed by oral administration of vehicle, Ginkgo leaf extract(24 mg/kg), procyanidins(50 or 150 mg/kg) respectively. The spatial learning and memory performance was recorded as the acquisition trial and probe trial in the Morris water maze. The levels of malondialdehyde(MDA), glutathione(GSH), total antioxidant capacity(T-AOC) and the activity of superoxidedismutase(SOD) in the brain tissue were determined by colorimetric Assay Kit. The gene expression of Bax and Bcl-2 in the rat hippocampus was detected by real-time PCR.ResultsThe vascular dementia rats treated with procyanidins showed decreased escaped latency during acquisition training, especially at the dose of 150 mg/kg, procyanidins also increased exploration time and frequency of crossing in the target quadrant during probe trial. The administration of procyanidins induced increase in GSH, T-AOC contents and SOD activities with lowering MDA levels in the brain. In addition, procyanidins upregulated the Bcl-2/Bax ratio of mRNA expression in the rat hippocampus.ConclusionProcyanidins could have potentials for improving the spatial cognition with VD，which was possibly due to the antioxidative and anti-apoptotic effects of polyphenol.

procyanidins; vascular dementia; oxidative stress;apoptosis

周 恒(1987-)，男，硕士研究生.E-mail:zhouheng.555@163.com.

徐江平. Tel：(020)61648236，E-mail:jpx@fimmu.com.

R965.1

A

1006-0111(2011)03-0208-04