婴儿配方粉中克雷伯氏菌的检出及污染情况

卢雁，王瑶，于宁，王淼，房玉国，王旻

（1.国家乳制品质量监督检验中心,哈尔滨150086;2.清华大学生命科学学院，北京100086；3.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150086）

婴儿配方粉中克雷伯氏菌的检出及污染情况

卢雁1，王瑶2，于宁3，王淼1，房玉国1，王旻1

（1.国家乳制品质量监督检验中心,哈尔滨150086;2.清华大学生命科学学院，北京100086；3.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150086）

对婴儿配方粉中肠杆菌科细菌进行筛查，检出婴儿配方粉中污染了肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌，检测样本241份，污染几率分别为5.0%和2.5%。所采用的检验方法为VRBGA结合MIAC进行分离，采用API20E和VITEC2进行生化鉴定。

婴幼儿配方粉；肺炎克雷伯氏菌；产酸克雷伯氏菌

0 引言

在流行病学和微生物学上都有证据表明，被污染的婴儿奶粉是婴儿患病的传播媒介和传染源的被定义为A类致病菌，代表细菌是阪崎肠杆菌[1]、肠炎沙门氏菌；对婴儿致病，已从奶粉中检出，但无论是流行病学还是微生物学都不能很明确地表明，被污染的婴儿奶粉是婴儿传染病的传播媒介和传染源的被定义为B类致病菌，代表细菌是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等[2]。

肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌属于克雷伯氏菌属（Klebsiella），是重要的条件致病菌，该菌产生胞外毒性复合物，有些菌株还可产生肠毒素。易于耐药[3]。即使生产符合现行卫生标准，婴儿配方奶粉也不是无菌产品。这就是说，它有时可能含有引发严重疾病的病原体，生产乳粉的企业也没有对此菌进行监测。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用菌株：肺炎克雷伯氏菌菌株CMCC46117，产酸克雷伯氏菌菌株ATCC49334。

仪器试剂：微生物实验室常规仪器。胰化大豆蛋白琼脂（TSA）、肠杆菌增菌肉汤（EE）、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA），肌醇柠檬酸盐琼脂（SCAI），麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂（MIAC）；API20E、VITEC GNI生化鉴定卡。

1.2 方法

1.2.1 肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌的检测

无菌称取样品100，10，1 g各3份，加入已预热至44℃分别盛有900，90，9mL灭菌蒸馏水中（定量检验）或样品100 g加入900 mL无菌蒸馏水（定性检验），轻轻振摇使其充分溶解，制成1∶10样品匀液，置36℃±1℃培养18～24 h[4]。取10 mL加入90 mL EE肉汤，36℃±1℃培养18～24 h，取增菌培养物划线接种VRBGA、SCAI、MIAC，四区法划线平板，其中SCAI 36℃±1℃培养48 h，其余36℃±1℃培养18～24 h，培养获得单个菌落。同时观察参考菌株在各平板上菌落形态，将获得的单个菌落进行生化鉴定。

表1 克雷伯氏菌菌株在不同培养基上菌落生长形态

表2 克雷伯氏菌菌株的生化鉴定

图1 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂

图2 肌醇柠檬酸盐琼脂

2 结果与分析

2.1 菌落形态和生化鉴定

图3 麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂

表1为克雷伯氏菌菌株在不同培养基上菌落生长形态；表2为克雷伯氏菌菌株的生化鉴定；图1为结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂；图2为肌醇柠檬酸盐琼脂；图3为麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂。

肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌在以上各培养基上的形态特征类似，无法区分。产酸克雷伯氏菌一般分解色氨酸生成吲哚。该两种菌均发酵葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖。

筛选克雷伯氏菌，VRBGA平板选择性较差，所有肠杆菌科细菌都能生长，菌落呈紫红色或粉红色，不易判读目的菌。在SCAI平板上，典型菌落为黄色、突起、湿润、边缘整齐的较大菌落，但有些肺炎克雷伯氏菌会生长不良，可能会出现漏检。在MIAC培养基上，试验用克雷伯氏菌均形成湿润、光滑、边缘整齐的红色菌落，典型菌落突起、黏稠，相邻菌落会发生融合现象，背面观察菌落具深红色心，分离效果较好[5]。MIAC培养基具有很高的灵敏性，克雷伯氏菌产生β-内酰胺酶，所以梭苄青霉素不抑制克雷伯菌的生长[6]。

菌株确认：经过API20E确认均得到好的鉴定结果，对怀疑的鉴定结果再进行VITEK生化鉴定。实验室保留从样品中分离的野株。

结果报告：生化鉴定结果符合肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌的生化特征，应用MPN表查出每100 g样品中的MPN值，检测结果报告为每100 g样品中的最近似值（MPN值）。检索表数值范围（最近似值）为0.0036～0.023 g-1[7]。

3 讨论

2009年我实验室对样品进行肠道菌筛查，采用无菌水结合肠道增菌肉汤增菌，VRBGA结合显色培养基分离的方法，发现目前的婴儿配方粉已受到不同程度的污染，其中包括坂崎肠杆菌、克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、伤口埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌，非脱羧勒菌，其中坂崎肠杆菌为国家标准中严格明示不得检出的条件致病菌[8]，为A类致病菌，伤口埃希氏菌、阴沟肠杆菌与肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌同为B类致病菌。

Harry等人采用蛋白胨水结合肠道增菌肉汤增菌，VRBGA平板分离的方法，对35个国家141份婴儿配方奶粉中肠杆菌科的污染情况进行了调查，其中阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌的污染几率分别为14.2%，9.2%，2.8%[9]。天津出入境检验检疫局根据传统方法对在天津口岸进境的100份乳粉进行了克雷伯氏菌检测，这些奶粉分别来自新西兰、法国、澳大利亚、芬兰、比利时、美国、丹麦、瑞士和德国等9个国家，其中肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌的污染几率分别为4.0%和1.0%。我实验室根据传统方法结合行业标准[10]，检测样本241份，其中阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌的污染几率分别为1.7%，5.0%，2.5%。

这些条件致病菌在配方粉中早已被检出，克雷伯菌属细菌在自然界中广泛存在于土、水、谷物和人体肠道、呼吸道内，本属中的肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌对成人、婴幼儿致病性较强，特别是免疫力低下的人群将造成非常严重的后果，可引起支气管炎、肺炎、化脓性炎症、泌尿系统和创伤感染，甚至败血症、脑膜炎、腹膜炎及食物中毒等疾病[11-12]。

由于该菌55℃（30 min）就能被杀死，产品如被污染，不应在生产加工的前段工艺中，应为杀菌后产品的二次污染。由于此次检测发现阪崎肠杆菌监测检出率较低，而克雷伯氏菌监测检出率较高，说明乳制品企业生产环境不是对产品的微生物污染的唯一途径，可能还存在其他影响因素。由于克雷伯氏菌正常存在于人和动物的肠道中，如排除环境因素影响，产品如污染该菌属可能与环境中的工作人员有关，应当引起乳品加工企业的重视。

肠杆菌科细菌分布广泛，在干燥环境中比较常见，且容易检测。肠杆菌可作为生产过程及环境卫生状况的指标菌。很容易理解，肠杆菌科阴性的样品可以规避很多风险，沙门氏菌和阪崎肠杆菌为A类致病菌，是主要的目标微生物，所以可将肠杆菌作为卫生指标，对肠杆菌科的阪崎肠杆菌等条件致病菌实施有效管理，方可发现被忽视的轻度或间断性污染。这样才能更好的控制婴儿配方奶粉的质量，以保障特殊群体的哺喂安全。

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[2] CDC(USA),Enterobacter sakazkii infections associated with the use of powder infant formula Tennessee,2001[J].JAMA,2002,287(17):2004-2005.

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[5] 高虹,张霞,关淳.一种克雷伯氏菌分离培养基的研制[J].食品科学,2008,29(3).

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Detection and contamination about Klebsiella pneumoniae in the infant Formula Pouder

LU Yan1,WANG Yao2,YU Ning3,WANG Miao1,FANG Yu-guo1,WANG Min1
(1.National Dairy Testing Centre,Northeast Agricultural University,harbin 150086,China;2.College of Life Sciences,Tsinghua University,Beijing,100086 China;3.National research centre of dairy engineering and technology,harbin 150086,China)

Through the traditional separation methods for bacteria of Enterobacteriaceae of the infant formula,we found that it had been contaminated Klebsiella pneumoniae,Klebsiella oxytoca in 241 samples,the contaminated ratio is 5.0%,2.5%.The detection method is with the selective medium of VRBGA and MIAC and the identification testing is the API20E biochemistry testing and VITEC2 identification system.

infant formula；Klebsiella..pneumoniae；Klebsiella..oxytoca

TS252.7

A

1001-2230（2011）03-0056-03

2010-07-22

卢雁(1979-),女,工程师,从事食品微生物学的检验与研究。