高效液相色谱法测定奶粉中卵磷脂的质量分数

王飞，农云军，苏流坤，窦文渊，石燕丽

（中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广州510070）

高效液相色谱法测定奶粉中卵磷脂的质量分数

王飞，农云军，苏流坤，窦文渊，石燕丽

（中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广州510070）

建立了奶粉中卵磷脂（PC）的高效液相色谱-蒸发光散射检测的测定方法，奶粉经去蛋白-液液萃取-富集浓缩超滤后进高效液相色谱仪，采用硅胶色谱柱，正己烷-异丙醇-水(体积比31∶62︰7)流动相体系，等度洗脱能够快速有效地分离奶粉中的卵磷脂。线性范围为0.020～1.60 g/L,相关系数为0.9996,检出限为15 mg/L,加标回收率为95.2%～96.8%。该方法用于实际样品的测定，结果令人满意。

高效液相色谱；蒸发光散射检测；奶制品；卵磷脂

0 引言

磷脂酰胆碱（PC）俗称卵磷脂，具有重要的生理功能和乳化性能，被广泛应用于食品、保健品和医药等行业[1]。在奶粉行业中，卵磷脂作为一种乳化剂，被喷涂在奶粉表面可显著增强其亲水性，增加奶粉的分散性，达到速溶的目的，同时卵磷脂又起到了营养保健的作用。但是卵磷脂作为一种食品添加剂，喷涂于奶粉中时一般允许添加量小于0.4%[1]，所以建立一种快速、灵敏、有效的测定奶粉中卵磷脂含量的方法在保障食品安全方面有重要意义。

目前卵磷脂的检测方法主要有分光光度法[2-4]、薄层色谱法[5，6]、荧光分光光度法[7]、核磁共振法[8]和高效液相色谱法[9-11]等。近年来，对保健品中卵磷脂的分析研究报道较多，但对于奶粉中卵磷脂的测定还没有国家标准，文献报道的只有分光光度法[2]，步骤繁琐复杂。本文建立了奶粉中卵磷脂含量的高效液相色谱测定法,可以满足实际样品分析的要求，为从事食品安全检测人员提供了一定的参考信息，为制定统一的检测标准提供了方法学基础。

1 实验

1.1 仪器和试剂

LC-20A液相色谱仪（包括二元梯度泵，自动进样器、控温箱、控制系统）；Alltech-2000蒸发光散射检测器；岛津LC solution色谱工作站。磷脂酰胆碱、蛋白酶、正己烷、异丙醇均为色谱纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 色谱条件

色谱柱:UltimateTMSiO(4.6×250 mm,2.5 μm)；流动相：正己烷-异丙醇-水(体积比31∶62∶7)，柱温为35℃；流速为1.0 mL/min。蒸发光散射检测器氮气流速2.6 L/min,漂移管温度80℃。

1.3 标准溶液的配制

磷脂酰胆碱标准储备液:准确称取磷脂酰胆碱50 mg,置于25 mL容量瓶,用正己烷-异丙醇（体积比为1︰1）超声溶解定容，配置成质量浓度为2.00 g/L的标准储备液。

磷脂酰胆碱标准工作液：取标准储备液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，5.0，6.0 mL分别用正己烷-异丙醇（体积比为1︰1）稀释至10 mL,配置成质量浓度为20，40，80，160，320，640，1000，1200 mg/L系列标准工作溶液。

1.4 样品处理

精密称取样品10.0 g，加入适量水溶解，再加入蛋白酶除去蛋白，过滤，滤液置于分液漏斗中，用正己烷萃取3次，合并滤液和洗液，减压蒸馏正己烷至干，残渣用正己烷-异丙醇（体积比为1︰1）溶解定容5.00 mL。

2 结果与讨论

2.1 样品的提取纯化和富集

奶粉成分十分复杂，如果不进行提取纯化，会很大程度地干扰结果的测定，因此我们必须要把样品的前处理做好，才能保证卵磷脂被有效地分离。经过多次实验，分析得到的谱图，最终确定样品先用适量的蛋白酶去除蛋白，离心过滤后得到的上清液再用正己烷萃取3次，合并滤液和洗液，再减压蒸馏进行浓缩，最后残渣用正己烷-异丙醇（体积比为1︰1）溶解定容5.00 mL。

2.2 色谱条件的选择和优化

卵磷脂的紫外吸收比较弱，用紫外检测器在205 nm波长下检测干扰物质多，结果不稳定。本文采用蒸发光散射检测器（ELSD）这种质量型检测器，其响应取决于被分析质粒的数量和大小，在不含共轭结构或无紫外吸收物质的分析中具有相当的优势，避免了卵磷脂用紫外检测仅限于极短波长处干扰物质大的缺陷。根据实验室的实际情况，反复摸索实验条件最终确定采用正相色谱柱，以正己烷-异丙醇-水体系作为流动相，溶剂背景噪声最低。

图1 卵磷脂高效液相色谱

改变流动相体系中正己烷和异丙醇的比例，对卵磷脂的峰形和出峰时间都有一定的影响，加大异丙醇的比例可以改善峰形，但却延长了分析时间，结果表明，采用正己烷-异丙醇的体积比为31︰62时最为合适。流动相体系中水的加入量主要影响卵磷脂的出峰时间，增加水的加入量，则使卵磷脂出峰时间加快。但是若卵磷脂出峰时间太快，目标峰和杂质的分离度会降低，不利于定量分析。实验结果表明，正己烷-异丙醇-水的体积比为31∶62︰7效果最好，色谱峰对称性好，保留时间适中，适用于定量分析（见图1）。

2.3 线性范围和检出限

取不同浓度的标准品溶液，在选定的色谱条件下测定，以峰面积S的对数为纵坐标，进样质量M的对数为横坐标作图，得线性回归方程为ln S=9.679+1.551ln M,相关系数r为0.9996。线性范围为0.020～1.60 g/L,检出限为15 mg/L（S/N=3）。

2.4 精密度实验

用质量浓度为1.00 g/L的卵磷脂标准溶液，进样10 μL，连续进样6针，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.15%和1.12%。

2.5 平行性实验

按照“1.4”方法处理方法，取某品牌奶粉均匀取样6份，按照上述色谱测定条件对其中的卵磷脂含量进行测定，结果如表1，相对标准偏差（RSD）为0.93%。

表1 平行性实验结果

2.6 回收率实验

取适量含卵磷脂的奶粉样品，在最佳的实验条件下，按照“1.4”方法处理样品，同时按加入本底平均值50%～150%的标准品做回收率实验，结果如表2。

表2 回收率测定结果（n=5）

3 结论

本文采用HPLC-ELSD方法测定奶粉中卵磷脂的质量分数，并按照方法学要求对方法的线性范围、检出限、精密度、重现性以及加标回收率等参数进行了确定。该方法分析时间短（约20 min），灵敏度高，该方法用于实际样品的测定，结果令人满意,为从事食品安全检测人员提供了一定的参考信息，在保障食品安全方面有着重要的意义。

[1] 代忠波，丁卓平.卵磷脂的研究概况[J].中国乳品工业，2006,34（1）：48-51.

[2] 庞玉珍，王玉静.速溶奶粉中卵磷脂含量的测定[J].中国乳品工业，1998,26（3）：46-47.

[3] 刘伟娟，张均媚，薛刚.乳粉中卵磷脂含量的测定[J].食品研究与开发,2005，26（1）：139-140.

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[5] 徐桂云，常理文.大豆磷脂组成的薄层色谱分析[J].分析化学,1998，26（1）：81-84.

[6] 马辰，段宏瑾.大豆磷脂中磷脂类成分的含量测定[J].中国中药杂志,1999,24(11):671-672.

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[8] 肖朝萍，王红，卓玉华.核磁共振磷谱与分光光度法联合测定卵磷脂样品中卵磷脂含量[J].广西化工，2000（S1）：196-196.

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Determination of milk-powder Phosphatidycholine by high performance liquid chromatography

WANG Fei,NONG Yun-jun,SU Liu-kun,DOU Wen-yuan,SHI Yan-li
(Guangdong Key Laboratory of Emergency Chemical Test,China National Analytical Center,Guangzhou 510070,China)

A method for the determination of milk-powder Phosphatidycholine（PC）by HPLC-ELSD was developed.PC in milk-powder was successfully separated on a SiO chromatography column,using hexane-isopropanol-water(31∶62∶7,v/v/v)as mobile phase after disposing protein,liquid-liquid extraction and concentration.The linear detection range was 0.020～1.60 g/L(r=0.9996)and the limit of detection(LOD)was 15 mg/L.The recovery was in the range of 95.2%～96.8%.The results of the actual sample indicated the method was accurate and reproducible.

high performance liquid chromatography;evaporative light scatter detector;milk-powder;phosphatidycholine

TS252.7

A

1001-2230（2011）03-0053-03

2010-11-08

广东省自然科学基金资助项目(7300055)。

王飞(1979-)，女，助理研究员，从事食品与环境分析检测。