胶束电动色谱法分析奶中两种主要的共轭亚油酸异构体

王腊梅,陈 燕,刘晓华,曹郁生

南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌大学中德联合研究院,南昌 330047

胶束电动色谱法分析奶中两种主要的共轭亚油酸异构体

王腊梅,陈 燕,刘晓华,曹郁生＊

南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌大学中德联合研究院,南昌 330047

以胶束电动色谱法对奶样中共轭亚油酸主要的两种异构体进行了分析。在优化条件下 (80 mM pH 9.0的磷酸盐缓冲液,54 mM SDS,4%(w/v)β-CD,8M尿素,4%(v/v)乙醇作为运行缓冲液,分离电压 25 kV,柱温20℃),胶束电动色谱可在 15 min内对奶样中两种主要 CLA,即 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA进行分离测定,最低检出限为 0.081 ng/mL。分析结果显示,不同处理奶样中的 CLA含量差异显著 (P＜0.001),但 CLA的组成相近,其中的 10t,12c-CLA含量差异不显著P=0.999,约为 3%;不同品种奶样,如牛奶、水牛奶和羊奶中的 CLA含量差异显著 (P＜0.001),其中 CLA含量次序为牛奶 ＞羊奶 ＞水牛奶,并且不同品种奶的 9c,11t-CLA与 10t,12c-CLA比例差异显著 (P＜0.05)。

共轭亚油酸;奶;胶束电动色谱法

Abstract:A micellar electrokinetic chromatography method was used to analyze the major conjugated linoleic acid(CLA)isomers in milk.Under the optimized conditions(80 mM borate(pH 9.0),54 mM sodium dodecyl sulphate,4%(w/v)β-cyclodextrin,8 M urea,4%(v/v)ethanol,25 kV and 20℃),the major CLA isomers 9c,11t-CLA and 10t,12c-CLA could be separatedwithin 15 min byMEKC.Limitof detection of thismethod is 0.081 ng/mL.The results indicated that there was a significant difference in the total CLA content among raw milks,pasteurized milk,UHT milk(P＜0.001).However,the content of 10t,12c-CLA from all samples was similar(3%).The result also showed there was a significant difference in the totalCLA content and 10t,12c-CLA content among the cow milk,goatmilk and buffalo milk.

Key words:conjugated linoleic acid;milk;micellar electrokinetic chromatography

共轭亚油酸(CLA)是一类位置和几何异构体十八碳共轭二烯酸的统称。天然的 CLA主要存在于反刍动物的奶和肉的脂肪中,含量很低,是一些食物中的天然成分。乳中有两种重要的共轭亚油酸异构体 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA,已经证明这两种CLA有着有益的生理活性[1],如 9c,11t-CLA具有抗癌[2,3],抗粥样动脉硬化[4],免疫调节的功能。而10t,12c-CLA对动物具有减肥和改善机体成分的作用,可以减少脂肪的合成[5,6]。这说明不同异构体有不同的生理活性。建立可靠的分析方法对确定食品中共轭亚油酸异构体组成,研究不同异构体的生理活性及共扼亚油酸产品的研究、开发和生产,都具有十分重要的意义。

目前,常用的分析 CLA的方法有高效液相色谱法、气相色谱法、气质联用法、傅立叶变换红外光谱法等。高效液相色谱法存在着分析时间长、试剂消耗量大的缺点,气相色谱法存在着衍生化过程复杂的缺点,而质谱法和红外光谱法都不能单独使用来确定 CLA各种异构体的组成。上世纪八十年代,Terabe等[7]发展的胶束电动色谱 (micellar electrokinetic chromatography,MEKC)做为毛细管电泳技术的一种分离模式,由于其高灵敏度、高分辨率、高效、快速、易自动化、污染小等优点,已迅速的应用于生命科学、食品科学、毒理学、药物学等领域。

乳是 CLA主要的天然来源,乳中 CLA的含量和组成常常受到季节、动物品种、加工方法、储存时间等因素的影响,快速准确的检测很有必要。本研究以胶束电动色谱法对奶样中两种主要 CLA异构体进行分析,对检测的方法、条件以及样品处理进行了优化,并对几种奶样中的 CLA含量组成进行了比较分析。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

十二烷基硫酸钠、甲醇、硼酸、硼酸钠、β-环糊精、氢氧化钠、盐酸、硫酸、乙醚、石油醚、硫酸钠、尿素均为国产分析纯。

9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA标品 (南昌华兴生物科技有限公司)。

1.2 仪器

PA/ECMDQ毛细管电泳系统 (Beckman),熔融石英毛细管 (70 cm×100μm i.d.,Beckman),PB602-E电子精密天平 (Mettler Toledo),PB10 pH计 (赛多利斯),TGL-16B台式离心机 (上海安亭科学仪器厂),超纯水制备器 (Mllipore),RK510S超声波脱气机 (Bandelin),旋涡混合器 (上海跃进医疗器械厂),氮吹仪,冰箱,超低温冰箱。

2 实验方法

2.1 奶样来源及取样

鲜牛奶来自南昌市某奶站;巴氏杀菌牛奶、UHT牛奶购自某超市;羊奶为市售品牌巴氏杀菌羊奶;水牛奶来自广西水牛研究所。

鲜牛奶和巴氏杀菌牛奶均当日测样,UHT(保质期分别为 40 d和 6个月)奶为保存 1个月所测样。各种奶样分别随机取 500 mL,作进一步分析。

2.2 奶样中乳脂的提取

奶样低温离心 (10000 r/min,15 min,4℃),取上层固体于三角瓶中,加入正己烷-异丙醇 (v/v,1∶1)混合液,超声波处理 30 min,取上层,无水Na2SO4过滤干燥 (使用前 110℃烘干 30 min),N2吹去有机试剂,-20℃保存待用。

2.3 乳脂皂化处理[8]

取已提取乳脂,加入 1 M KOH-C2H5OH,60℃水浴 1 h,反应结束后旋转蒸发除 C2H5OH,加水及乙醚适量 (乙醚除不皂化物),水层以 2 M H2SO4调至 pH=2.0令游离脂肪酸从水层游离,石油醚提游离脂肪酸两次,以无水 Na2SO4干燥,使用前除去石油醚。

2.4 电解液配制

2.4.1 母液的配制[9]

配制 80 mM的硼酸盐缓冲液 (配制于超纯水中),pH值为 9.0;将 SDS配制于 Borate中,浓度为54 mM。构成母液。

2.4.2 运行缓冲液的配制

将β-CD、尿素、乙醇直接加入母液,构成运行缓冲液。β-CD浓度为 4%(w/v),尿素浓度为 8 M,乙醇浓度为 4%(v/v)。

2.5 胶束电动色谱法分析 CLA条件

每次进样检测前,依次用甲醇洗柱 2 min,超纯水洗柱 2 min,1 M盐酸洗柱 5 min,超纯水洗柱 2 min,然后再用 1 M氢氧化钠和超纯水分别洗柱 10 min。

紫外检测波长:233 nm;分离电压:25 kV;毛细管柱温:20℃;进样方式:压力进样 0.5 psi.(l psi.=6894.76 Pa),10 s;阳极进样,阴极检测。

在每个样品电泳之间,用 0.1 M氢氧化钠洗柱2 min、超纯水洗柱 1 min、运行缓冲液洗柱 4 min。

2.6 标准曲线的绘制

准确称取 9c,11t-CLA及 10t,12c-CLA标品,以甲醇溶解 ,分别配制为 2.5、5、29、40、100、200、400、800、1000μg/mL的 9个浓度的标准液 ,按上述色谱条件经过分析,测得其峰面积,以标准溶液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,对峰面积和进样量进行一元线性回归分析。

2.7 最低检出限

从检测的最适浓度开始,降低进样标准品的浓度,直到得到仪器可定量的最低浓度,然后连续进样20次,计算其平均值,然后除以标准曲线回归方程的斜率,即为仪器的最低检出限。

2.8 数据分析及处理

用软件 SPSS16.0进行方差分析及 t检验,显著性水平取α=0.05。

3 结果与讨论

3.1 电泳条件的优化

参考刘晓华等报道的方法[9],对分离电压、柱温和进样时间进行了优化。

3.1.1 进样时间

固定分离电压和柱温,考察进样时间对分离的影响时发现,尽管进样时间越短,分离度越好,峰形越好,但峰电流会随进样时间而降低,峰的重现性会变差,影响分析的精确度。同时,适当的增加进样时间,可保证峰的重现性及分析的灵敏度,但分离度会下降。综合考虑以上,进样时间选择为 10 s,通过分离电压和柱温的选择来达到较好的分离分析效果。

3.1.2 分离电压

分离电压极大的影响着电渗流和焦耳热,从而影响分离度。增加电压会极大的减小出峰时间,达到较短的分析时间,但也会降低分离度。本实验的分离电压选择为 25 kV来改善分离度。

3.1.3 柱温

随柱温的增加,缓冲液粘度降低,电渗的速度加大,出峰时间会显著降低,分离度也会下降。本实验的柱温选择为 20℃来达到较短的出峰时间。

3.2 标准曲线绘制

取不同浓度的 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA标品进样,以标准溶液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,对峰面积和进样量进行一元线性回归分析。9c,11t-CLA标准曲线如图 1所示,y=731.21x+2872.6,R2=0.9977,说明在 2.5～1000 μg/mL范围内呈良好线性关系,在该浓度范围内可用于 CLA的定量分析。

10t,12c-CLA标准曲线如图 2所示,y=727.74x+4655.1,R2=0.9974,说明在 2.5～1000μg/mL范围内MEKC分析的峰面积同 10t,12c-CLA的进样浓度呈良好线性关系,可在该浓度范围内用于 CLA的定量分析。

图1 9c,11t-CLA标准曲线Fig.1 The standard curve of 9c,11t-CLA

图2 10t,12c-CLA标准曲线Fig.2 The standard curve of 10t,12c-CLA

3.3 方法精密度

取 9c,11t-CLA标品,以甲醇溶解,制备不同浓度的溶液,在 233 nm下测定,重复进样 3次,得出峰面积和保留时间的相对标准偏差 (RSD),结果如表所示。

表1 MEKC法分析 9c,11t-CLA的相对标准偏差Table 1 Relative standard deviation of 9c,11t-CLA deter mined byMEKC

由表可以看出,峰面积的相对标准偏差为1.459%～3.205%,保留时间的相对标准偏差为0.962%～1.822%。

3.4 方法回收率

取不同奶样进行乳脂提取,并经过皂化处理,分别加 9c,11t-CLA标品,在 233 nm下测定,重复进样5次,计算回收率,结果如表所示。

表2 MEKC法分析 9c,11t-CLA的回收率Table 2 Recovery rate of CLA determined byMEKC

2 100.530 100 200.405 99.875 3 203.724 100 307.968 104.244 4 283.639 200 483.113 99.737 5 318.943 200 509.823 95.440

由表可以看出,回收率为 95.440%～104.595%,RSD为 3.745%。

3.5 最低检出限

取 9c,11t-CLA标品稀释,进行MEKC分析。在响应值为基线噪音三倍时 (S/n=3),在 233 nm下测定,重复进样 20次,平均值为 59.49 ng/mL,根据下式计算最低检出限:

最低检出限 =s/b=59.49/731.21=0.081 ng/mL

经计算,该方法的最低检测限为 0.081 ng/mL,可用于低浓度样品的分析测定。

3.6 MEKC对共轭亚油酸两种异构体标品的分离

取 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA标品配为混合标品,在优化条件下以 MEKC分析,两种异构体可以得到有效分离,其出峰时间分别是:10t,12c-CLA为 10.5分;9c,11t-CLA为 11.0分 (图 3),分析时间不足 15 min,可用于大批量样品的 CLA分析测定。

图3 优化条件下MEKC分离 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA标品Fig.3 Chromatogram of the mixture of 9c,11t-CLA and10t,12c-CLA

3.7 MEKC法测定奶样中的 CLA

取不同奶样提取乳脂,经皂化处理,在优化条件下用MEKC进行分析。从图 4可见共轭亚油酸最大吸收波长为 233 nm。

图4 MEKC分析奶样的最大吸收波长Fig.4 Chromatogram of samples

对奶样中 CLA进行分析的MEKC图如图 5所示,根据标品的出峰时间判断该奶样中含有 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA。

图5 奶样中 CLA的MEKC分析图谱Fig.5 Chromatogram of samples analyzed byMEKC

在优化条件下对鲜奶、巴氏奶、UHT奶中的CLA异构体进行分析测定,结果如表 3所示。鲜奶、巴氏奶和 UHT奶中的 CLA含量差异显著 (P＜0.001),其 CLA含量次序为鲜奶 ＞巴氏奶 ＞UHT奶;但 CLA的组成相近,其中的 10t,12c-CLA含量差异不显著 (P=0.999),约为 3%。

表3 MEKC法对不同处理奶样中 CLA异构体的含量测定 (n=7)Table 3 CLA contents of different samples deter mined byMEKC(n=7)

在优化条件下对牛奶、水牛奶、羊奶中的 CLA含量进行分析测定,结果如表 4所示,牛奶、水牛奶、羊奶中的 CLA含量差异显著 (P＜0.001),其中水牛奶的 CLA含量仅为 2.972 mg/g乳脂,但是,各奶样中的乳脂率不同,有报道,每 100 mL水牛乳中可含有高达 8 g的脂肪,而羊奶和牛奶中这一数值仅为 3 g左右。并且,牛奶、水牛奶、羊奶中的 9c,11t-CLA与 10t,12c-CLA比例差异显著 (P＜0.05),羊奶中 10t,12c-CLA含量较高为 3.189%,而牛奶中的10t,12c-CLA含量仅为 2.388%。

表4 MEKC法对不同品种的奶样中 CLA异构体的含量测定 (n=7)Table 4 CLA content of different an imalmilk samples determined byMEKC(n=7)

4 结论

对MEKC的分离条件进行了优化,最佳条件为:分离电压 25 kV,柱温 20℃,进样时间 10 s。在优化的条件下,MEKC可对奶样中的 9c,11t-CLA与10t,12c-CLA进行较好的分离,出峰时间:10t,12c-CLA为 10.5分;9c,11t-CLA为 11.0分,分析时间不到 15 min,适合大批量样品的快速分析。峰面积的相对标准偏差为 1.459%～3.205%,保留时间的相对标准偏差为 0.962%～1.822%,回收率为98.105%～103.054%,说明该方法的精密度和准确度均较好。因此 MEKC法可用于奶样中 9c,11t-CLA 10t,12c-CLA两种主要异构体的分析测定,且该法的最低检出限为 ng级,更适合低浓度样品的分析。

以MEKC法对不同热处理奶中的 CLA异构体进行分析,结果显示鲜奶、巴氏奶中的 CLA含量较高,与 UHT奶差异显著 (P＜0.001)。鲜奶中的CLA总含量高达 9.288 mg/g乳脂,巴氏奶略低,其CLA总含量为 9.129 mg/g乳脂,而 UHT奶中的CLA总含量最低,保质期 40 d和 6个月的 UHT中总 CLA含量分别为 8.631 mg/g乳脂和 8.613 mg/g乳脂。各奶样的 CLA组成相近,10t,12c-CLA含量差异不显著P=0.999,约为 3%。以MEKC法对不同品种奶样中的 CLA进行分析,结果显示不同品种奶,如检测的牛奶、水牛奶、羊奶中的 CLA含量差异显著 (P＜0.001),其 CLA含量分别为:牛奶样为9.220 mg/g乳脂,水牛奶样为 2.972 mg/g乳脂,羊奶样为 6.054 mg/g乳脂,且 9c,11t-CLA与 10t,12c-CLA的含量和比例差异显著 (P＜0.05)。

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Separation of Conjugated Linoleic Acid Isomers in Milk by Micellar Electrokinetic Chromatography

WANGLa-mei,CHEN Yan,L IU Xiao-hua,CAO Yu-sheng＊
State Key Laboratory of Food Science and Technology,Sino-Ger man Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China

TS252.1;TS225.2

A

1001-6880(2011)01-0015-05

2010-04-02 接受日期:2010-10-14

＊通讯作者 Tel:86-791-8327754;E-mail:yyssccc@hotmail.com