马缨丹根:化学成分及抑制 H IV逆转录酶活性

何俊杰,郑炼付,霍天武,王婷婷,曾和平

华南理工大学化学与化工学院,广州 510640

马缨丹根:化学成分及抑制 H IV逆转录酶活性

何俊杰,郑炼付,霍天武,王婷婷,曾和平＊

华南理工大学化学与化工学院,广州 510640

用硅胶柱层析分离马缨丹 (Lantana camaraL.)根部乙醇浸提物获得 25个组分,其中三个组分对 H IV逆转录酶 (H IV reverse transcriptase,H IV RT)活性有抑制作用。使用减压柱层析从部分组分中分离获得了 6个五环三萜类化合物,它们的结构经波谱分析分别鉴定为齐墩果酮酸 (oleanonic acid,1)、路路通内酯 (liquidambaric lactone,2),马缨丹烯 A(lantadene A,3)、马缨丹烯 B(lantadene B,4)、齐墩果酸 (oleanolic acid,5)和 25-羟基 -齐墩果酸 (25-hydroxy-oleanolic acid,6)。其中,化合物 2和 6首次从马鞭草科植物中分离得到,同时,首次报道了化合物 6的单晶结构。

马缨丹根;H IV逆转录酶;五环三萜类化合物;单晶结构

Abstract:Among the 25 fractions obtained from the alcohol extractive of the roots ofLantana cam araL.(Verbenaceae)by silica gel column chromatography,three fractions demonstrated inhibitory H IV-1 reverse transcriptase activity.Further more,six pentacyclic triterpeneswere isolated by reduced pressure column chromatography and identified asoleanonic acid(1),liquidambaric lactone(2),lantadene A(3),lantadene B(4),oleanolic acid(5),and 25-hydroxy-oleanolic acid(6)by spectral analysis.Compounds 2 and 6 were reported firstly in the plants of Verbenaceae family,and the structure of 6 was confirmed firstly by X-ray crystallography.

Key words:roots ofLatana camara L.;H IV RT;pentacyclic triterpenes;single crystal structure

马缨丹 (Lantana camaraLinn.)系马鞭草科马缨丹属直立或蔓性灌木,世界十大有害杂草之一[1,2];主要分布在我国东南沿海城市,近年来在野外迅速蔓延,严重破坏生态系统[3,4]。因此,深入探究马缨丹的化学成分是开发利用该植物从而有效控制其种群数量的先决条件。

马缨丹具有广泛的药用价值,茎干有发汗、解热、驱风、解痉和止痛的作用[5],在该植物内发现了用于肝炎临床辅助治疗的齐墩果酸和乌苏酸,其根部酒精浸提物还有解眼镜蛇毒的功效[6]。潘文斗[6,7]和朱峰[8]等先后研究了其根部酒精浸提物中能溶于甲醇的大极性化合物和挥发油成分,然而,中等极性部位化学成分的研究还未曾报道。为了更深入的研究其根部化学成分,本文对其根部中等极性成分进行研究,从其根部乙醇浸提物中得到 6个五环三萜类化合物,分别为齐墩果酮酸 (1)、路路通内酯 (2),马缨丹烯 A(3)、马缨丹烯 B(4)、齐墩果酸(5)和 25-羟基-齐墩果酸 (6)。化合物 2和 6首次从该科植物中获得,化合物 2较为少见,其生物活性研究还未见报道,化合物 6对癌症有一定程度的抑制作用[9]。为了证实化合物 6的空间构型,我们获得了该化合物的单晶结构 (剑桥数据库编号:CCDC 768076)。首次对马缨丹 H IV RT抑制物的研究表明马缨丹对 H IV RT活性有抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和试剂

熔点用 X-4显微熔点仪测定 (未校正),红外光谱用 Bruker TensoR27红外光谱仪 (KBr压片),MS采用 Esquire HCT PLUS型质谱仪和测定,HRMS用英国VG公司 ZAB-HS型双聚焦磁质谱测定 (EI源),NMR谱用 VAR IAN INOVA-400核磁共振仪测定 (T MS为内标),单晶衍射数据采用 Rigaku/MSC Mercury CCD单晶衍射仪测定。所用 GF254和 H型薄层层析硅胶及柱层析硅胶均为青岛海洋化工厂生产,乙酸乙酯、石油醚为广东光华化学厂有限公司产品。使用 EnzChek逆转录酶试剂盒 (E-22064)进行H IV逆转录酶活性的测定。

1.2 植物来源、提取和分离

马缨丹根部于 2009年 3月份采自华南理工大学校园内,由华南师范大学植物学教授王小菁鉴定,标本编号 G-1,收藏于本实验室。

将 1.7 kg新鲜马缨丹根用铡刀切片后放入5000 mL广口瓶中,用 95%酒精浸泡 4个月,过滤,浸提液减压浓缩得浸膏,浸膏用已填装 30 cm高硅胶 (100～200目)的层析柱 (4.5×45 cm)进行分离。先用石油醚洗脱除脂,再以石油醚-乙酸乙酯 (76∶24)洗脱,定量收集,用薄层层析 (展开剂均为石油醚-乙酸乙酯)检验合并相同流分,浓缩,获得组分 F1～F12;石油醚-乙酸乙酯 (60∶40)洗脱得组分 F13～F15,100%乙酸乙酯洗脱得组分 F16～F25。F2做减压柱层析获得 F2A～F2F,F2D和 F2E在乙醇和二氯甲烷中反复重结晶分别得到 1(40 mg)和 2(40 mg)。F3于石油醚-乙醇中反复重结晶获得 3(500 mg)。F4和 F5做硅胶柱层析后,再用石油醚-乙酸乙酯反复重结晶后获得 4(200 mg)。F6用薄层层析硅胶 H做减压柱层析后再用乙醇中做分步结晶获得 5(120 mg),在乙醇中对 F15做分步结晶,获得 6(16 mg)及其单晶。

1.3 抑制 H IV RT活性组分的筛选

在 25个组分当中选择了 F3～F11,F21～F25共十一个组分,以及对照品齐多夫定 (AZT)和依非韦伦 (Efavirenz),所有样品浓度均配制为 1μmol/mL,然后用 EnzChek逆转录酶试剂盒,按照文献[12]所述方法进行测定,然后以 Efavirenz对 H IV逆转录酶抑制率为 100%,分别计算各组分相对于 Efavirenz的抑制率。

2 结果和讨论

2.1 化合物的结构

2.1.1 路路通内酯 (liquidambaric lactone,2)

无色透明晶体,mp.＞300℃。APCI-MS显示分子峰[M]+468,I R吸收信号说明环内酯羰基及酮羰基的存在,这被13C NMR进一步证实。13C NMR信号集中在 10～60 ppm之间,1H NMR显示有 7个甲基,推测该化合物为三萜类化合物并确定了其齐墩果烷型碳骨架。13C NMR证明该化合物不含sp2碳原子,与齐墩果酮酸在 C-12和 C-13之间是双键的结构不同,推测该位置双键与羧酸形成内酯结构,同时解释了13C NMR中 87.4 ppm处的信号。90°DEPT谱显示了五个次甲基,应以齐墩果酮酸结构基础在两个亚甲基上增加取代基。1H NMR中 3.07 ppm处有两个 H,HSQC显示1H NMR中 3.07 ppm的两个氢分别属于化学位移为 57.7 ppm和 52.5 ppm的两个叔碳,I R没有醇羟基氢的吸收,推测存在环氧结构。参考文献[10],鉴定了该化合物。

2.1.2 25-羟基-齐墩果酸 (25-Hydroxy-oleanolic acid,6)

无色透明方晶体,IR吸收说明存在羰基和碳碳双键。其13C NMR和1H NMR数据同齐墩果酸较为相似,两者的碳骨架相同。1H NMR显示只有 6个甲基接在季碳上,同时 3.7 ppm左右处增加了 2个 H的多重峰,故考虑一个甲基被羟基所取代,羟基质子对应 4.22 ppm处的三重峰。化合物 6在 20 ppm以下只有三个信号,故推测被取代的甲基应为 24-C、25-C或 26-C中的一个。

为进一步验证该化合物的立体构型,我们培养了其单晶,做了 X-衍射实验。经解析该化合物的单晶 X-衍射数据得到其分子式 C30H48O4,Mr=472.68:晶体属正交晶系 (Orthorhombic):晶胞参数:a=12.2744(12)nm,b=13.7679(13)nm,c=15.5493(14)nm:α =90.00°,β =90.00°,γ =90.00°:V=2627.7(4)nm3,Dc=1.195 g/cm3,Z=4,F(000)=1040,μ =0.077 mm-1。R1=0.0498,ωR2=0.0940。

2.1.3 化合物 1、3、4和 5的结构

将化合物 1、3 、4和 5的熔点、I R、MS、1H NMR和13C NMR数据与文献报道的数据[6,11]对比,确认化合物 1为齐墩果酮酸,化合物 3为马缨丹烯 A,化合物 4为马缨丹烯B,化合物 5为齐墩果酸。

2.2 各组分对 H IV RT活性抑制作用

马缨丹根部酒精浸提物经硅胶柱层析分离获得组分 F1～F25,再以 Efavirenz为阳性对照 (抑制率100%),AZT为阴性对照,测定并计算了 F3～F7、F10～F11、F23～F25共十一个组分的相对抑制率,相对抑制率高于 AZT即表示有抑制作用。结果显示,F6,F7和 F11,三个组分对 H IV RT活性有一定抑制作用,作用最明显的是组分 F6,见图 1。三个组分当中的单一化合物对 H IV RT的抑制作用正待深入研究。

图1 各组分浓度为 1μmol/mL时对 H IV RT的相对抑制率Fig.1 Relative inhibitory rate of each fraction on H IV RT at a concentration of 1μmol/mL

3 结构鉴

化合物 1 银白色针状晶体 (乙醇-二氯甲烷),产率 0.002%,mp.167～168℃:APCI-MSm/z:454[M]-1。H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.34～5.26(1H,br,12-H),2.83(1H,dd,J=13.6,3.72 Hz,18-H),2.55(1H,m,2β-H),2.37(1H,m,2α-H),1.14,1.08,1.05,1.03,0.93,0.91,0.80(8×CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:15.0,17.0,19.5,21.4,22.8,23.4,23.5,25.8,26.4,27.6,30.7,32.1,32.4,33.0,33.8,34.1,36.8,39.1,39.2,40.9,41.7,45.8,46.6,46.8,47.4,55.2,122.3,143.6,184.2,217.8;I R(KBr)ν:3500～3100,2955,1731,1665,1490,750 cm-1。

图2 化合物 1～6的结构Fig.2 Compounds 1-6 isolated fromLantana camara

化合物 2 无色透明晶体 (乙醇-二氯甲烷),产率0.002%,mp.＞300℃:APCI-MSm/z:468[M]+。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:3.07(2H,br,11β,12β-H),2.67(1H,m,21β-H),2.44(1H,m,21α-H),2.34(1H,d,J=13.7 Hz,18-H),2.23 ～2.08(1H,m,2-H),1.87(1H,t,J=13.5 Hz,1-H),1.19,1.10,1.06,1.00,0.93(5×CH3),1.12(6H,br,2 ×CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:16.4,18.7,18.7,19.8,21.1,21.2,23.6,25.9,26.7,26.9,30.4,31.4,33.2,33.8,34.2,36.2,37.7,38.6,40.5,41.2,43.8,47.6,49.5,50.0,52.5,54.7,57.0,87.4,179.3,216.3;IR(KBr)ν:3065～2854,1768,1691,1601,1449,760 cm-1。

化合物 3 无色透明方晶 (乙醇-石油醚),产率0.029%,mp.292～293℃:ESI-MSm/z:553[M+1]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:6.00(1H,q,J=7.2 Hz,33-H),5.38(1H,br,12-H),5.09(1H,s,22α-H),3.05(1H,dd,J=13.7,3.6 Hz,18-H),2.56(1H,m,2β-H),2.37(1H,m,2α-H),1.77,1.18,1.09,1.06,1.05,1.00,0.90,0.83(8×CH3),1.98(3H,d,J=7.4 Hz,34-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:15.1,15.1,15.6,16.8,19.4,20.6,21.4,23.5,24.2,25.8,26.1,26.4,27.5,30.0,32.1,33.7,34.1,36.7,37.6,38.3,39.0,39.2,41.9,45.9,46.8,47.4,50.5,55.2,75.8,122.4,127.5,139.0,143.1,166.2,180.4,217.7;IR(KBr)ν:3700～2800,1710,1645,1460,1383,1229,1148 cm-1。

化合物 4 无色透明方晶 (乙酸乙酯-石油醚),产率 0.012%,mp.260～262℃;FAB-MSm/z:575[M+Na]+,553[M+H]+,535[M+H2O]+,452[M+C5H8O2]+,407,83(100%):HRESI-MS calcd for C35H52O5[M]+552.3809,found 552.3805。 IR(KBr)ν:3282,2950,1738,1711,1650,1462,1385,1229,1139 cm-1。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.57(1H,d,J=1.2 Hz,33-H),5.39(1H,t,J=3.4 Hz,12-H),5.05(1H,t,J=3.0 Hz,22α-H),3.03(1H,dd,J=13.8,4.1 Hz,18-H),2.56(1H,m,2β-H),2.37(1H,m,2α-H),1.18,1.09,1.07,1.05,1.01,0.89,0.85(7×CH3),2.14(3H,d,J=1.0 Hz,34-CH3),1.84(3H,d,J=1.0 Hz,35-CH3):13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:15.2,16.9,19.5,20.2,21.5,23.6,24.1,25.8,26.3,26.5,27.4,27.6,30.1,32.3,33.7,34.1,36.8,37.6,38.6,39.2,39.2,42.1,46.0,46.9,47.4,50.6,55.3,75.2,116.0,122.4,143.1,157.0,165.3,178.7,217.7。

化合物 5 针状晶体 (乙醇),产率 0.007%,mp.289～290 ℃.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.28(1H,t,J=3.4 Hz,12-H),3.22(1H,dd,J=11.1,4.5 Hz,3-H),2.82(1H,dd,J=13.7,4.2 Hz,18-H),1.13,0.98,0.93,0.91,0.90,0.77,0.74(7×CH3;13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:15.3,15.5,17.1,18.3,22.9,23.4,23.6,25.9,27.1,27.6,28.1,30.7,32.4,32.6,33.1,33.8,37.1,38.3,38.7,39.2,40.9,41.5,45.8,46.5,47.6,55.2,79.0,122.6,143.6,183.8;I R(KBr)ν:3470,3058,2928,1693,1610,1490,1450 cm-1;ESI-MSm/z:456[M]-。

化合物 6 无色透明方晶 (乙醇),产率0.0009%,mp.181～183℃;ESI-MSm/z:472[M]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:5.11(1H,t,J=3.4 Hz,12-H),4.28(1H,d,J=5.2 Hz,3-OH),4.22(1H,t,J=4.6 Hz,25-OH),3.75(2H,m,25-H),3.01(1H,m,3-H),2.72(1H,dd,J=13.7,4.07 Hz,18-H),1.07,0.90,0.83,0.70(4×CH3),0.87(6H,2×CH3);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:16.7,17.9,18.2,23.0,23.8,23.8,25.0,26.5,27.7,28.3,29.4,30.8,32.6,33.2,33.3,33.5,33.7,38.8,41.2,41.2,41.9,45.8,46.1,48.6,55.4,59.7,77.6,123.0,143.6,179.1;I R(KBr)cm-1:3454,2935,2859,1693,1624,1450,1025。

选取化合物 6的单晶,大小为 0.26 mm×0.22 mm ×0.16 mm,用 Rigaku/MSCMercury CCD单晶衍射仪,在 298 K下采用经石墨单色化的Mo Kα射线(λ=0.071073 nm)作入射辐射,以φ/ω扫描方式在1.98°≤θ≤25.20°范围内收集到 13676个衍射数据,其中独立衍射点为 4730个 (Rint=0.0314),可观测的衍射点 3945个 [I＞2σ(I)],见表 1。晶体结构解析采用直接法,由 SHELXL-97程序完成。氢原子坐标由理论加氢确定,非氢原子坐标通过全矩阵最小二乘法进行各项异性温度因子修正,最终得到了化合物 6分子的立体结构,见图 3。经检索该晶体结构为首次报道。

图3 化合物 6的分子结构Fig.3 Molecular structure of compound 6

表1 化合物 6的晶体学数据Table 1 Crystal structure parameters of compound 6

致谢:该项目得到华南理工大学国家大学生创新性实验计划 (项目编号:B15Y9080010)的资助,同时获得国家自然科学基金 (20671036),广东省科技计划项目 (2007A010500008,2008B010800030)的资助,实验中各组分对 H IV RT活性的抑制作用由南方医科大学药学院抗病毒研究中心李润明博士测定,特此致谢!

1 Pei J(裴鉴 ),Chen SL(陈守良 ).Flora of China(中国植物志).Beijing:Science and Technology Press,1982,65:17.

2 Ghisalberti EL.Lantana camaraL.(Verbenaceae).Fitoterapia,2000,71:467-486.

3 Lin Y(林英),Dai ZC(戴志聪 ),Si CC(司春灿 ),et al.A study survey and prospect on invasive condition and invasive mechanism ofLantana camaraL..J Hainan Norm Univ,Nat Sci(海南师范大学学报,自科版),2008,21:87-93.

4 Jiang ZL(蒋智林),LiuWX(刘万学),Wan FH(万方浩),et al.Effects ofLantana camarainvasion on lawn soil nutrient properties.J Yunnan Agric Univ(云南农业大学学报),2009,24:159-163.

5 Wu P(吴萍 ),Li ZZ(李振中 ),Li A(李安 ).To study on the effects of analgesic and sedation of Lamtana camara L.by water-alcohol extracted location.Prim J Chin Mat Med(基层中药杂志),2002,16:20-21.

6 PanWD(潘文斗 ),Li YJ(李毓敬 ),Mai LT(麦浪天 ),et al.Studies on triterpenoid constituents ofLantana camara.Acta Pharm Sin(药学学报),1993,28:40-44.

7 PanWD(潘文斗),Li YJ(李毓敬),Mai LT(麦浪天),et al.Studies on chemical constituents of the roots ofLantana camara.Acta Pharm Sin(药学学报),1992,27:515-521.

8 Zhu F(朱峰 ),Li Y(利越 ),Peng Y M(彭毓敏 ),et al.A-nalysis on the chemical constituents of the roots ofLantana camaraL.by GC/MS.J Foshan Univ Nat Sci(佛山科学技术学院学报,自科版),2005,23:33-35.

9 Fukuda Y,Sakai K,Matsunaga S,et al.Cancer chemopreventive activity of lupane-and oleanane-type triterpenoids from the cones of Liquidamber styraciflua.Chem B iodiver,2005,2:421-428.

10 Sun YR(孙玉茹),Sun YF(孙友富).Structure elucidation of liquidambaric lactone.Acta Pharm Sin(药学学报),1996,31:437-440.

11 SeebacherW,Simic N,Weis R,et al.Complete assignments of 1H and13C NMR resonances of oleanolic acid,18a-oleanolic acid,ursolic acid and their 11-oxo derivatives.Magn Reson Chem,2003,41:636-638.

12 Victoria LS,Laurie JJ,Stephen TY,et al.Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA Quantitation.Anal B iochem,1997,249:228-238.

Roots of Lantana camara:Chemical Constituents and HIV-1 Reverse Transcriptase Inhibitory Activity

HE Jun-jie,ZHENGLian-fu,HUO Tian-wu,WANG Ting-ting,ZENG He-ping＊
School of Chemistry and Chem ical Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China

R248.2;Q946.91

A

1001-6880(2011)01-0025-05

2010-01-11 接受日期:2010-04-20

华南理工大学国家大学生创新性实验计划 (项目编号:B15Y9080010)的资助,同时获得国家自然科学基金(20671036),广东省科技计划项目。

＊通讯作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:zenghp@scnu.edu.cnv