P(St-g-NIPAAm)支架的制备与细胞生长行为研究

陈广涵 朱文卿 徐建江 沈新元

良好的支架材料有助于引导细胞的生长,决定着所构建组织的形态,对于组织工程角膜的构建意义重大[1]。

组织工程角膜研究主要应用胶原、羊膜、壳聚糖等天然高分子材料作为支架材料,但或多或少都存在细胞黏附力低、降解速率低和可能引起医源性感染等缺点。人工合成智能高分子聚 N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)由于具有良好的温敏特性,因此在生物和制药等方面具有广阔的开发应用前景[2～4]。有关PNIPAAm的研究很多,但大多集中在药物释放、酶的固定化以及生物分离等方面,而将 PNIPAAm用于组织工程材料的研究则很少报道[5,6]。Nishida[7]等首次将其制成温度敏培养皿用于培养角膜缘干细胞,并获得了成功。

本研究将温敏性合成聚合物PNIPAAm接枝于组织培养用的聚苯乙烯培养皿(TCPS)表面,利用改变温度来调控细胞的黏附,为利用温度敏感性支架材料构建组织工程角膜缘干细胞奠定了基础。

材料与方法

1.试剂与仪器:异丙基丙烯酰胺(NIPAAm),分析纯,Tokyo chemical industry(日本);异丙醇,分析纯,上海试剂一厂;电子加速器,上海先锋电机厂;傅里叶变换红外光谱(FTIR):Thermo NicoletModel Nexus 670型红外光谱仪,美国 Nicolet公司;视频接触角测量仪,Dataphysics公司(德国);差示扫描量热:Q 2000DSC,美国 TA仪器;扫描电子显微镜(SEM):JSM—5600LV型,JEOL日本电子株式会社制造

2.实验方法:(1)P(St-g-NIPAAm)支架的制备:将NIPAAm溶于异丙醇,配成 55wt%的溶液,取该溶液 50μl滴于聚苯乙烯(PS)膜表面,摇匀,使其在膜表面充分蔓延。用电子加速器对其进行电子束辐射。最后以蒸馏水清洗膜表面,去除未接枝上的单体和其他杂质。(2)接枝率的计算:将反应物和生成物称重,根据下式计算反应的接枝效率:GE(%)=[(Wg-Wn)/Wm]×100%。其中 Wg、Wn和 Wm分别代表接枝物(St-g-NIPAAm)共聚膜、PS膜和异丙基丙烯酰胺NIPAAm的重量。(3)支架化学结构的测定:将PS膜及P(St-g-NIPAAm)支架样品通过 KBr压片,用红外光谱仪分别测定其红外光谱。(4)支架温度敏感性的测定:使用差热分析仪测定共聚物的转变温度,观察其峰值。氮气气氛保护,温度由从 20℃升温到 50℃(升温速率为 2℃/min)。(5)支架亲/疏水性的测定:将共聚膜置于测量平台上,滴水,用接触角测量仪观察液滴的形态变化,并记录所测接触角数据。(6)支架溶胀性能的测定:称出膜的干重,将干膜浸于蒸馏水中,在20℃到 50℃区间内分别做升降温处理,并称重。支架的溶胀率(swelling ratio,SR)由下式求得:SR=[(ms-md)/md]×100%。式中 ms为湿膜的重量,md为干膜质量。(7)P(St-g-NIPAAm)支架的细胞培养与生长行为测定:将剪下的兔口腔黏膜组织用 PBS液浸泡 0.5h,将其置于直径为 3cm2的P(St-g-NIPAAm)支架表面,将支架浸入 0.25%DispaseⅡ中于 4℃过夜。在超净台中撕下口腔黏膜上皮,置入加有0.05%胰酶-EDTA的培养皿于 37℃恒温摇床中,消化 20min后在离心机离心,去上清液,加培养液混匀。按 106/ml细胞密度接种在用丝裂霉素处理过的 3T3滋养层细胞的培养皿中,加入培养液 8ml,放入 37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中,培养 3～4天后首次换液,之后隔天换液。利用倒置相差显微镜观察细胞的形态及生长情况,并拍照。标本置于 HE染色,然后在光学显微镜下观察其形态。

结 果

1.聚合反应的接枝率:原 PS膜质量 Wn=0.3270mg,NIPAAm质量 Wm=0.0362mg,将制得的共聚物干燥后称量,得共聚膜质量 Wg=0.3412mg。按接枝率的计算式得到接枝率为 39.2%。

2.P(St-g-NIPAAm)支架的化学结构:比较图1中的图谱 a、b,我们发现图谱 b在 1506cm-1处的-NH2振动吸收峰因变形运动和羰基 -C=的作用而移至图谱 a中的 1647cm-1处,同时图谱 a在1548cm-1处出现 CNH弯曲振动吸收峰(酰胺Ⅱ峰),这证明 NIPAAm已经接枝到 PS上了。

图1 PS及 P(St-g-NIPAAm)支架的红外光谱图

3.P(St-g-NIPAAm)支架的温度敏感性:比较图2中的曲线(a)、(b),P(St-g-NIPAAm)支架有一个较为明显的吸收峰,最大的峰值即为相转变温度或最低临界溶解温度(LSCT)。因为当温度低于其LCST时,P(St-g-NIPAAm)会在水中高度溶胀,而当温度高于 LCST时,P(St-g-NIPAAm)会剧烈收缩失水而发生相分离。由图2可知,P(St-g-NIPAAm)的转变温度与 NIPAAm的转变温度很接近,在 36℃附近。

图2 PS及 P(St-g-NIPAAm)支架的差热分析图

4.支架亲/疏水性的判定:由图3观察,测定 3组数据,计算得水滴与膜表面接触角平均值(表1)为 46.9°＜90°,因此判定 PS-g-NIPAAm为亲水性膜。

图3 3次测量的 P(St-g-NIPAAm)接触角照片

表1 P(St-g-NIPAAm)的接触角度数(°)

5.P(St-g-NIPAAm)支架的溶胀性能:由图4可知,P(St-g-NIPAAm)支架的溶胀比对外界操作温度具有明显的温度依赖性,其突变温度大约为34℃左右。当支架从室温开始升温,在 LCST以下时发生溶胀,溶胀比较大;当温度超过 LCST以后,支架又收缩,使溶胀比大大减小。当将支架从 45℃开始进行降温处理时,溶胀比随着温度的降低而增大;当温度低于 LCST时,支架的溶胀程度太大以至于无法测定。这说明这种支架的温度响应性是可逆的。

图4 P(St-g-N IPAAm)支架的溶胀比图

6.P(PS-g-NIPAAm支架的细胞形态及生长情况:图5表明,倒置相差显微镜下,原代细胞贴壁前为体积较小的圆形、类圆形细胞,胞质均匀、透亮,轮廓清晰光滑,倒置相差显微镜下有立体感。接种后12h,部分细胞下沉贴附于培养孔底,24～96h细胞继续贴壁,数量逐渐增多。细胞为折光性强的圆形细胞。随后细胞逐渐伸展,胞质逐渐展开,细胞扁平变大,折光性减低,整个细胞变暗,细胞核清晰可见,位于胞质中央。完全伸展的细胞呈扁平的卵圆形,胞核清晰,细胞大小是伸展前的 2～3倍。此阶段细胞增殖不明显,核分裂象少见。接种 5天后细胞加速增殖,核分裂象多见,细胞数量明显增多。上皮细胞逐渐生长融合成片,如铺路石状,细胞大小均一。原代培养 12天左右细胞融合(图5、图6)。

光学显微镜下,HE染色可见细胞为类圆形,胞核蓝染,胞质粉红。细胞连接成片,呈铺路石状,可见各期核分裂象(图6)。透射电镜下,上皮细胞核大呈圆形或卵圆形,胞质内可见正常细胞器,胞质内含大量的张力纤维,呈网状或束状排列,细胞表面有许多微绒毛(图7)。

图7 透射电镜观察到的上皮细胞形态及生长情况(×1500)

图8表明,细胞传代接种后第 1～4天为静止生长期,细胞黏附、伸展,增殖缓慢。随后细胞开始增殖活动,第 6～11天处于快速生长期,第 13天后进入平台期,细胞出现接触抑制,生长速度逐渐减慢。3个培养皿形成克隆数分别为 10、12、14;直径35mm培养皿的底面积约为 8cm2,克隆形成率(%)={[(10+12+14)/3]/(200×8)}×100=0.75%。

图8 细胞生长曲线图

讨 论

1.聚合方法:辐射聚合法是把 X射线或 γ射线等作为引发能量应用于聚合反应,从而制得热敏高分子膜。本实验中高能电子束是通过电子加速器发生的,它能将低压交流电转变成高压直流电,从加速管中射出,由磁扫描器在水平方向进行扫描,并穿过钛窗对产品进行辐射加工。实验中选取累计照射剂量为 0.25MGy,既达到了材料接枝的要求,又不至于因过度照射而引起材料透光性的改变。

2.温度敏感性机制:温度敏感性水凝胶随环境温度的变化而发生的体积相转变,从本质上讲是一种相分离过程,必有其特定的相变热。本研究中,在干态的时候没有观察到共聚膜的相转变峰,当把膜重新浸入水中达到平衡时,又能观察到转变峰,这个相转变是由于水分子和链段之间的相互作用。这说明 PS-g-NIPAAm具有温敏性,并且其温度响应过程完全可逆。

3.溶胀和脱溶胀机制:NIPAAm的溶胀过程是水分子向凝胶内部扩散与凝胶侧链上亲水基团形成氢键的过程。溶胀过程实际上是两种相反趋势的平衡过程:溶剂渗入共聚物膜内部使体积膨胀,从而引起三维分子网络的伸展,分子链的伸展降低了它的构象熵值,引起了分子网络的弹性收缩力,使分子网络收缩。当这两种相反的作用相互抵消时,就达到了溶胀平衡。

4.培养体系:国外培养角化细胞多采用 3T3细胞作为滋养层[8～10]。3T3细胞是 Swiss鼠胚胎成纤维细胞,该细胞使用前需经射线照射或丝裂霉素 C处理,使之失去增殖能力,但仍可成活,具同化培养液的能力。当角化细胞散落在其上与之接触后,它可促使角化细胞贴壁形成克隆。上皮细胞扩展将3T3细胞推向一边,随后 3T3细胞逐渐死亡。本实验即利用 3T3细胞促使口腔黏膜上皮细胞贴壁,还抑制混入的成纤维细胞的生长,利于得到较纯的上皮细胞。

5.培养基:角化细胞需要复杂营养,在培养体系中需提供与之共同生长的成纤维细胞、较高的胎牛血清浓度、较高的种植密度及多种辅加成分。本实验采用成品角化细胞培养液,其中含胰岛素、上皮细胞生长因子等,细胞增殖较快,活力较好。

6.培养方法:本实验采用酶消化法(dispase)进行培养。dispase是一种快速、有效、作用温和的分离上皮与真皮的酶。它是从多黏杆菌中提取的中性蛋白酶。在分离上皮时,dispase作用于基膜,选择性地分解纤维连接素和Ⅳ型胶原,而保存上皮细胞活力及细胞连接。与胰蛋白酶相比,dispase只是将上皮分离而不分解单个角化细胞,可在保留上皮细胞活力与连接的同时将上皮层与上皮下层自基膜处完全分离,从而可得到单一的上皮细胞,故本实验采用 dispase分离口腔黏膜上皮细胞与其结缔组织。

7.生长特性:(1)细胞生长曲线:细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法,一般细胞生长曲线近似“S”形,在传代后经几天的潜伏适应期后进入快速生长期,达平台期后生长稳定,最后逐渐衰老。图8表明,本实验发现体外培养兔口腔黏膜上皮细胞第 6～11天为其快速生长期,第 13天之后进入平台期,细胞密度趋于恒定。(2)克隆形成率:克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一[8]。通过计数克隆形成率,可对单个细胞的增殖潜力作定量分析,了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。克隆形成率与众多因素相关,从培养条件来说,与底物、培养液、血清的量和质等有关,也受温度、pH的影响。从细胞方面来说,一般原代培养细胞弱,传代细胞强;所有细胞的克隆形成率均受接种细胞密度的影响。本实验将体外培养的原代口腔黏膜上皮细胞制成分散的悬液后,以密度为 200/cm2接种到底物上时,发现克隆形成率达到0.75%,证明体外培养的口腔黏膜上皮细胞具有一定的增殖潜力。

由此得出如下结论:(1)采用辐照反应将异丙基丙烯酰胺 P(NIPAAm)接枝在聚苯乙烯(PS)培养皿的膜表面上,制备了具有温度敏感性的聚[苯乙烯 -g-异丙基丙烯酰胺][P(St-g-NIPAAm)]支架。(2)3T3细胞在 P(St-g-NIPAAm)上成功生长,并具有一定的增殖能力。

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2 周加祥,刘铮.生物分离技术与过程研究进展[J].化工进展,2000,19(6):38-41

3 任现文,江明.原位聚合法制备温敏性聚合物核壳胶束的响应温度调控及其负载行为[J].高等学校化学学报,2006,27(11):2204-2208

4 张先正,卓仁禧.快速温度敏感(N-异丙基丙烯酰胺 -co-丙烯酰胺)水凝胶的制备及性能研究[J].高等学校化学学报,2000,21(7):1309-1311

5 黄健,王晓琳,陈秀珍,等.(N-异丙基丙烯酰胺)的体积相转变及分离领域中的应用研究[J].高分子材料科学与工程[J],2001,17(6):35-39

6 陈莉,李世庚,肖飞,等.温敏性壳聚糖共聚膜的制备与细胞吸附/脱附行为[J].高等学校化学学报,2008,29(5):1061-1064

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8 Chang SE,Fosler S,Beels D,et al.DOK,a cell line established from human dysplastic oralmucosa,shows a partially transformed nonmalignant phenotype.Int JCancer,1992,52:896-902

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