EGFR基因突变检测与肿瘤指标相关性研究

徐 琳 郑明峰 张 稷 朱幸沨 陈 若 陆荣国 吴 波 陈静瑜

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种受体酪氨酸激酶。经多种机制激活后,通过一系列信号转导过程将增殖信号传导至细胞核,发挥调节细胞的增殖、存活及血管生成等作用。一系列研究发现,在某些 NSCLC亚型中,EGFR的基因突变率非常高,达 40%以上,而且这些突变均发生在 EGFR酪氨酸激酶区的 ATP结合域附近,90%位于外显子 19和外显子 21上,且各个位点突变无统计学意义[1]。大量的回顾性研究表明,对 EGFR-TKI治疗有效的 NSCLC患者的 EGFR突变率为77%,但是存在约 20%对吉非替尼敏感的 NSCLC的患者不存在 EGFR突变,提示 EGFR对吉非替尼疗效是一个必不可少的因素。基因检测指导使用 EGFR-TKI药物治疗非小细胞肺癌将成为今后肺癌治疗的主要方向。EGFR突变基因检测需要手术标本,文献报道,非小细胞肺癌患者,尤其是老年非小细胞肺癌患者中有 33%为Ⅰ或Ⅱ期,而仅 6%得到手术治疗[2]。相关实验提示提示:非小细胞肺癌患者 EGFG基因表达距肿瘤边缘 3cm以内癌旁组织表达较高,6cm以远的正常肺组织表达不明显[3]。在基因靶向治疗的重要性逐日突显时,对不能手术的非小细胞肺癌患者如何选用分子靶向治疗药物尤为重要。大量实验及文献已证明[4]EGFR基因突变在亚裔、女性、非吸烟、腺癌患者中发生率较高。EGFR基因突变(此处我们选择突变率高的外显子 19和外显子 21)与临床肿瘤指标(CEA、CA125、CA199)是否有联系?我们选取临床上 78例进行手术的肺癌患者进行分析。

材料与方法

1.临床标本资料:2010年 1～10月期间在无锡市人民医院胸外科行手术切除并经病理学证实为非小细胞肺癌的 78例患者进入本研究。标本选择手术标本,使用甲醛固定液保存。其中男性 40例,女性 38例,平均 63.3岁。腺癌 63例,鳞癌 12例,大细胞癌 2例,腺鳞癌 1例。吸烟 31例,均为男性;吸烟年限均超过 30年,吸烟指数均 ＞400支/年;不吸烟者 47例,9例为男性,38例为女性。临床分期为Ⅰ期 45例,Ⅱ期 23例,Ⅲ期 3例,Ⅳ期 7例。所有肺癌患者术前均未行化放疗、分子靶向药物治疗。

2.研究方法:(1)基因组 DNA提取:新鲜肿瘤组织经 4%中性甲醛固定 12～24h后行石蜡包埋、切片、常规苏木素 -伊红(HE)染色,选择典型肿瘤细胞巢部位,以组织微阵列取直径 2mm组织芯,排列人包含 60个组织芯的受体蜡块,行厚4μm连续切片,应用 PCR直接扩增 EGFR基因第 19、2l外显子的基因片段。扩增片段包含外显子及其相连的内含子部分。PCR反应条件为变性 95℃15min;变性 94℃ 30s,退火65℃ 30s和延伸 72℃ 1m in,35个循环;最后延伸 72℃ 5min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段,通过Alpha Innotech凝胶成像系统观察 PCR产物电泳结果。采用Chromas软件分析测序图谱,分析判断 EGFR基因第 19、2l外显子突变区域(表1)。(2)所有患者初入院时抽取清晨空腹静脉血 3m l,分离血清,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清癌胚抗原CEA、糖类抗原 CA 125、糖类抗原 CA 199。

3.统计学方法:各种比较均采用卡方检验。

表1 第 19、21号外显子 PCR引物序列

结 果

1.EGFR基因突变表达:78例 NSCLC患者的EGFR突变率为 55.1%,其中 16例患者发生了第 19号外显子缺失突变,突变率为 20.5%,27例患者发生了第 21号外显子 L858R点突变,突变率为 34.6%。

2.肿瘤指标与病理表达:37例 NSCLC患者 CEA表达阳性,占 47.44%,均为腺癌。28例患者 CA125表达阳性,占 35.90%。11例患者 CA199表达阳性,占 14.1%。

3.EGFR突变与肿瘤指标的相关性:37例 CEA表达阳性者,其中EGFR阳性率有 25例,占 67.57%。

4.统计分析:EGFR基因突变阳性患者的血清肿瘤指标 CEA阳性表达有统计学意义,与 CA125、CA199表达无统计学意义(表2)。

表2 78例 NSCLC患者 EGFR基因突变与CEA、CA 125、CA 199相关性[n(%)]

讨 论

EGFR是表皮生长因子受体(ErbB)家族的一员。ErbB是一组跨膜糖蛋白,属于 I型跨膜酪氨酸激酶家族,是将细胞外信号传递到细胞核内的重要途径,其功能的发挥需要与相应的配体结合,从而调控正常细胞的增殖、分化。EGFR蛋白由定位于人类染色体7p11-13上的 HER-1基因编码,为Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体,相对分子质量 70×103kDa,定位于细胞膜上,由胞外区、跨膜区、胞内区 3部分组成,广泛分布于除血管以外的上皮细胞膜上。目前的大量研究显示:NSCLC患者 EGFR的突变均发生在酪氨酸激酶域 ATP结合域附近(第 18～21外显子),表现为 1个或一段碱基的缺失、插入以及碱基替换引起的错义突变,这些突变可以引起酪氨酸激酶的活性增强[5]。Scorpions ARMS检测到 42例突变,其中90%以上突变发生在第 19和 21外显子。Pao等[6]研究表明第 19外显子多个核苷酸框架缺失突变,位于 EGFR TK活化部位,都包含共同的碱基序列缺失(第 747～750个密码子),分别编码亮氨酸、精氨酸、谷氨酸、丙氨酸(LREA),这一序列在脊椎动物中高度保守,说明它在 EGFR功能中起重要作用。第 21外显子点突变位于 EGFR TK活化环高度保守区附近,使 858位上亮氨酸被精氨酸替代(L858R)。本试验 EGFR检测与既往结果一致。

癌胚抗原(carcinoecmbryonic antigen,CEA)属于细胞表面的糖蛋白家族,这一家族基因位于 19号染色体,可分泌 36种不同的糖蛋白,最主要的一种即CEA。CEA存在于细胞膜上属于免疫球蛋白超家族成员中的细胞黏附分子,具有同嗜和异嗜黏附功能,在肿瘤转移中可能起重要作用[7]。Plavec等测定的73例原发性肺癌患者术前血清 CEA值,阳性率为60%,其中腺癌的阳性率达 87.9%,鳞癌与 SCLC的阳性率分别为25.9%和13.3%,特异性为 99%,阳性预测值为97%。显示 CEA对诊断腺癌的临床价值较大。而 CA是由一组糖基转移酶综合作用产生的基因产物,当细胞癌变时,肿瘤糖类抗原能从各种不同组织或转移癌中分离出来,而正常的组织则不存在。

本研究 78例肺癌患者中,EGFR基因突变阳性与血清肿瘤指标 CEA表达阳性具有统计学意义,而与 CA125、CA199表达无统计学意义。我们考虑肺腺癌患者血清 CEA阳性表达率高,与肺腺癌患者 EGFR基因突变率高相一致,通过本研究,EGFR基因突变阳性与血清肿瘤指标 CEA表达阳性有统计学意义(P=0.036)。因而对不能进行手术治疗获取手术标本进行 EGFR基因检测时,我们选择肿瘤指标表达CEA阳性的 NSCLC患者接受 EGFR-TKI行一线治疗,或者化疗后序贯给予 EGFR-TKI维持治疗或者化疗间期间断给予 EGFR-TKI交替给药方案可能会取得更好的疗效。是否与肿瘤患者的预后有一定的相关性,为化疗后序贯靶向治疗提供一定的依据,尚待进一步研究。

1 Chan SK,GullickWJ,HillME.Mutations of theepidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer search and destroy.Eur JCancer,2006,42(1):17-23

2 Dexter EU,Jahangir N,Kohman LJ.Resection for lung cancer in the elderly patient.Thorac SurgClin,2004,14(2):163-171

3 Sequist LV,Bell DW,Lynch TJ,et al.Molecular predictors of response toepidermal growth factor receptor antagonists in non-small-cell lung cancer.JClin Oncol,2007,25(5):587-595

4 Lynch TJ,Bell DW,Sordella R,et al.Activatingmutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.NEngl JMed,2004,350(21):2129-2139

5 Paez JG,Janne PA,Lee JC,et al.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinib therapy.Science,2004,304(5676):1497-1500

6 PaoW,Miller V,ZakowskiM,et al.EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from"never smokers"and are associated with sensitivity of tumors to gdltinib and erlotinib.Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(36):13306-13311

7 Salgia R,Harpole D,Herndon JE,et al.Role of serum tumor markers CAl25 and CEA in non-small cell lung cancer,Anticancer es,2001,21(2B):1241-1246