醋酸配伍前后生脉散中多糖含量的变化

傅华洲 李伟平 朱学鑫 蒋福升 丁志山

生脉散由人参、麦冬和五味子组成,具有生津止渴、益气养阴、固表止汗等功效,在临床上得到了广泛的使用,尤其是对于心血管疾病,疗效确切[1]。与人参麦冬组成的参麦方剂相比,生脉散往往具有更强的疗效。楚延等研究发现生脉注射液增强实验动物非特异性免疫功能和心肌细胞耐缺氧能力明显优于参麦注射液。有报道称生脉注射剂对非特异性炎症具有显著的抗炎作用,而参麦注射液则无此作用[2]。可见,五味子配伍对参麦的药效具有显著的影响。在中医方剂中常常见到含酸性成分中药和含碱性成分中药同处一方配伍应用的情况,这些配伍往往能对方剂的化学成分和药效产生一定的影响[3]。五味子中含有大量的五味子酸,它的配伍是不是五味子酸在起酸碱药对的作用。为对此进行研究,本研究用 HAC代替五味子来研究五味子中的有机酸在配伍中是否起到作用。多糖是生脉散中重要组成成分之一,具有多种药理学活性。为探讨生脉散全方独特疗效的物质基础,本研究采用硫酸苯酚法分别对人参麦冬水煎液、人参麦冬配伍五味子后的水煎液、五味子水煎液和人参麦冬与 5%HAC共煎液中的多糖含量进行了测定。

材料与方法

1.实验主要材料和试剂:麦冬(产地:辽宁,浙江中医药大学饮片厂);五味子(产地:浙江,浙江中医药大学饮片厂);硫酸(分析纯,杭州大方化学试剂厂);苯酚(分析纯,杭州大方化学试剂厂);乙腈(色谱纯,临海市浙东特种试剂厂);甲醇(分析纯,浙江杭州大方化学试剂厂)。

2.实验主要仪器设备:电热恒温水浴锅(DK-S24上海森信实验仪器有限公司);LDZ5-2低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂);S54紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司);UV 8500紫外分光光度计(上海天美光学仪器有限公司);R-201旋转式蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司);电子精密天平(AR2130 Ohaus Corp.Pine Brook,NJ,USA)。

3.实验方法:(1)供试品溶液和标准品溶液的制备:1)供试品溶液的制备:按以下配方称好药材:A生脉散组:人参 2g,麦冬 4g,五味子 2g;B参麦组:人参 2g,麦冬 4g;C五味子组:五味子 2g;D参麦加 HAC组:人参 2g,麦冬 4g。上述药材称好后,A、B、C均加 10倍量水提取 3次,D加 10倍量的 5%HAC溶液提取 3次,每次提取时间为 1h,合并 3次过滤液,4℃保存备用[4]。2)标准品溶液的制备:称取干燥至恒重的葡萄糖 20.4mg,用蒸馏水定容到 100ml,即得 0.2mg/ml的葡萄糖溶液,4℃密封保存备用。

(2)测定波长的选择:取 0.2mg/ml的葡萄糖标准品溶液,稀释 4倍。精密吸取 0.2ml,加入 5%的苯酚 0.2ml,立即摇匀,然后加入 1m l的浓 H2SO4,振摇 5min,置沸水浴中15min,再冷水浴 10min,备用。同时取 A供试品溶液,分别加蒸馏水稀释 800倍,精密吸取 0.2ml,加入 5%的苯酚 0.2ml,立即摇匀,然后加入 1ml的浓 H2SO4,振摇 5min,置沸水浴中15min,再冷水浴 10min。以蒸馏水替代糖溶液,如上法配制空白。然后紫外做全波长扫描。

(3)显色条件的选择:以显色剂 5%苯酚用量,硫酸用量及反应时间为考察因素,采用正交设计考察显色条件。因素与水平见表1。

各组反应完全后,490nm测定吸光度。分析最佳的显色剂加入量。

(4)标准曲线的制备:取 0.2mg/ml的葡萄糖溶液,分别取 250μl、500μl、750μl、 1000μl、 1250μl、 1500μl、1750μl、2000μl。稀释到 3ml,取 0.4m l加入 5%苯酚 0.4ml和浓H2SO42ml反应适当时间后,在 490nm测定吸光度,以吸光度为横坐标,葡萄糖浓度 (mg/ml)为纵坐标,制备标准曲线。

(5)换算系数的测定:精确量取供试样品溶液适量,加水稀释后,精确吸取 0.4m l,照“标准曲线制备”项下方法测定吸收度,从回归方程求出多糖供试液中葡萄糖浓度C,按下式计算换算系数 f=W/CD,式中:W为样品多糖重量(μg),C为多糖溶液中葡萄糖的浓度(μg/m l),D为多糖的稀释倍数。

(6)方法学考察:①精密度考察:精密量取 A供试品溶液适量,共 6份,稀释 800倍后,取 0.4ml加入 5%苯酚 0.4ml和浓H2SO42ml,490nm测定吸光度,考察实验方法的精密度;②稳定性考察:精密吸取 A样品溶液,稀释800倍后,取 0.4m l加入 5%苯酚 0.4m l和浓 H2SO42ml,每隔 30m in测定吸光度,共测定 3次,考察其在 90m in内的稳定性;③加样回收试验:精密量取葡萄糖标准品适量,加入到已知浓度的 A供试品溶液中按样品测定同样的方法进行测定,按测定标准曲线同样方法测其吸光度值,按以下公式计算回收率,考察测定方法的准确度。回收率 =(实验测值-样品所含被测成分量)/加入标准品量 ×100%。

(7)样品中多糖含量的测定:各样品按照上述的方法加入硫酸和苯酚,490nm测定吸光度,然后按测定标准曲线同样方法测吸光度值,按下式计算多糖含量:多糖含量(%)=CDf/W×100%。式中:W为样品多糖重量(μg),C为多糖溶液中葡萄糖的浓度(μg/ml),D为多糖的稀释倍数,f为换算系数。

结 果

1.紫外全波长扫描结果:全波长扫描结果见图1。通过全波长扫描,发现样品在 490nm有最大吸收峰,葡萄糖标准品在 488nm有最大吸收峰。两者相差仅 2nm。结合硫酸苯酚法的原理:糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物,在线性范围内其颜色深浅与糖的含量呈正比,且在 490nm附近波长下有最大吸收峰,故本实验选择 490nm为测定波长。

图1 全波长扫描图

2.显色条件选择:显色剂考察结果见表2(n=3,平均RSD=2.01%):

表2 L 9(33)正交设计显色结果

分析数据结果,发现对显色影响最大的因素是硫酸的加入量,其次是苯酚的加入量。最佳的显色条件是 A1B1C3,即加入 0.5倍的苯酚,5倍的硫酸,沸水中反应时间为 30min。

3.标准曲线:结果发现,标准曲线方程为 Y=6.9985X+0.0197,R2=0.9989。葡萄糖在 0.017～0.136mg/ml范围内吸光度与葡萄糖加入量线性关系良好(图2)。

图2 标准曲线图

4.方法学考察结果及醋酸配伍前后生脉散中多糖含量的变化:本实验结果发现,用硫酸苯酚法来测定生脉散中多糖含量,测定方法准确可靠,平均回收率为 98.15%,RSD=3.22%(n=6)。实验研究结果表明,生脉散配伍前后,多糖含量有明显的变化。生脉散中多糖的含量较高,但生脉散中配伍五味子后,多糖的含量下降了 4.7%。用 HAC代替五味子后,多糖的含量下降了 15.4%,具体见表3。

表3 多糖含量测定结果

讨 论

中药配伍应用是中医用药的基本形式,中药复方的作用不同于单味药的简单加和,传统的煎煮过程中成分的改变对复方的整体疗效是有利的[5]。复方在煎煮中发生了复杂的物理和化学变化,强化对组分之间相互作用的研究有助于深化对中药药理认识,因此通过研究配伍前后化学成分的变化时研究中药配伍规律的重要手段。生脉散由人参、麦冬和五味子组成,是中医治疗气阴两虚证的基本方,成分较为复杂,主要含皂苷和多糖等成分。研究者对其配伍后各化学成分的变化的研究也取得了一定的进展。

目前有研究表明,生脉散全方在煎煮过程中人参皂甙发生了水解变化,麦冬、五味子与人参配伍都能对人参皂甙的含量产生影响[6]。但是,目前尚未见有关研究生脉散配伍前后多糖含量变化的报道,多糖是生脉散水煎液中重要组成成分,兼具有人参多糖、麦冬多糖和五味子多糖各自活性作用,同时还具有 3种多糖的配伍协调作用,疗效显著,作用机制复杂[7]。本研究探讨了五味子配伍前后生脉散复方中多糖类成分的变化,结果发现配伍五味子后,生脉散中多糖的含量有所下降,这表明在生脉散的煎煮过程中,五味子一定程度上抑制了生脉散多糖的煎出或促进了多糖的转化。吕惠卿等[8].也报道称五味子配伍麦冬后使麦冬水提液多糖含量明显减少,这与本研究的结果是一致的。本实验可以为进一步揭示生脉散的配伍规律提供实验依据。

从酸性化学成分类角度探讨方剂药效作用物质基础变化规律具有重要的意义。有研究者[9]在实验中以 5%HAc,50%HAc溶液与人参配伍,观察酸性条件下人参皂苷的变化,发现以 HAc代替五味子进行煎煮,人参皂苷的变化结果与人参、五味子配伍情况相一致。该研究表明酸性在生脉散煎煮过程中起重要的作用,故本实验对醋酸代替五味子配伍后对生脉散复方中多糖类成分的变化进行了探讨。结果发现,用 HAc代替五味子进行煎煮后,生脉散复方中多糖的含量变化趋势与用五味子配伍情况相一致,通过本研究可以推断五味子配伍前后引起生脉散中多糖类成分的变化可能是由于五味子酸引起的。有研究表明[10],生脉散复方中五味子配伍后将产生 5-羟甲基 -2-糠醛(5-HMF),5-HMF是糖在高温或酸性等条件下脱水形成的醛类化合物[11],在本实验中发现,在五味子和 HAC配伍后,生脉散中的多糖含量下降,结合文献[10]五味子酸能促进生脉散中 5-HMF的形成,我们推断五味子和 HAC配伍后,五味子酸的酸性以及 HAC的酸性促使生脉散中的多糖类成分转化成了 5-HMF,但这还需要进一步的研究来证实。

1 中华人民共和国药典委员会.中国药典 2010版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:653

2 张燕,杨晓林.试述生脉注射液与参麦注射液的区别.实用中医药杂志,2008,24(10):683

3 裴妙荣,王世民,张淑蓉,等.“酸碱对药”在方剂中的配伍化学研究新思路,中国中医药科技,2007,14(5):357-358

4 张加雄,王凌.生脉散配方颗粒的提取工艺研究.西南国防医药,2010,20(4):359-361

5 李伟东,蔡宝昌.中药复方化学研究思路与方法.美中医学,2006,3(4):6-9

6 裴妙荣.中医方剂化学.中国中医药出版社,2008:260-276

7 胡闻莉,刘文英,吴春勇,等.生脉散多糖的组成及其初级结构分析.中国药科大学学报,2002,33(1):38-41

8 吕惠卿.麦冬与不同药味配伍水提液中多糖含量的测定.中国中医药科技,2006,14(1):5

9 朱丹妮,严永清,李志明.生脉散复方化学动态变化与药效关系的研究——生脉散复方化学的研究(Ⅲ).中国中药杂志,1998,23(8):483-486

10 朱丹妮李志明 严永清生脉散复方化学动态变化与药效关系的研究——生脉散复方化学的研究(Ⅱ).中国中药杂志,1998,23(5):291-292

11 周福富,廖爱国,刘风景,等.不同因素对 5-羟甲基糠醛含量的影响.中国药业,2008,17(19):44-45