七叶皂苷钠对油酸制备急性肺损伤大鼠模型的疗效观察

王 彤 田 巍 倪 莉

急性肺损伤(ALI)是指在严重感染、休克、创伤等非心源性疾病时,肺毛细血管内皮和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿,导致急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。各种原因引起 ALI的发病机制、病理变化和临床过程较相似,共同病理基础是:肺泡 -毛细血管急性损伤,通透性增强,肺间质淤血、渗出、水肿,肺泡透明膜形成和肺泡萎缩,而造成肺通气与血比例失调,分流量增加,机体呈低氧血症、严重缺氧状态,肺部影像学为非均一性的渗出性病变[1,2]。ALI是临床常见危重症,病死率高,威胁重症患者生命,影响存活患者生活质量。多年来,已对 ALI进行大量基础和临床研究,在发病机制和治疗方面已取得一定进展,但有关 ALI治疗方法还没有突破,目前的干预手段和方法较有限,主要有原发病治疗、呼吸支持治疗及药物治疗[1,3,4]。抗炎抗渗出消肿胀药、有类激素作用的七叶皂苷(简称七叶)对 ALI的治疗情况尚不明了。本研究在前期实验基础上,观察不同剂量及时间七叶对 ALI模型大鼠的作用,探讨七叶对 ALI治疗的合适剂量及远期疗效,为临床 ALI的防治提供实验依据和新药物选择。

材料与方法

1.材料:油酸,分析纯,北京益利精细化学品有限公司,批号 20060416;甲强龙,辉瑞制药有限公司,批号NF0567;七叶皂苷钠注射液,山东绿叶制药有限公司,批号 200704144。

2.实验过程:雄性 SD大鼠 96只,体重 200～250g(北京大学第一医院实验动物中心提供),随机分 16组:空白对照 2h、6h、18h组(n=18),模型 2h、6h、18h组(n=18),七叶高剂量2h、6h组(n=12),七叶中剂量 2h、6h、18h组 (n=18)、七叶低剂量 2h、6h组(n=12),甲强龙 2h、6h、18h组(n=18),每小组6只大鼠。采用鼠尾静脉缓慢注射油酸(0.1ml/kg)复制 ALI模型,模型复制 30min后对七叶各剂量组大鼠静脉注射七叶6mg/kg,2mg/kg和 1mg/kg,对甲强龙组大鼠静脉注射甲强龙5mg/kg[5]。除七叶高、低剂量组处理 2h、6h观察外,其他组处理 2h、6h和 18h观察。至相应时间点,用 1.25%戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉大鼠,放血处死,留取血和肺组织标本,低温冷冻保存待测。

3.检测指标:(1)动脉血氧分压(PaO2):大鼠麻醉开腹,血气针穿刺腹主动脉取血 1ml,PHOX血气分析仪检测 PaO2。(2)肺湿/干重比值(W/D):大鼠麻醉开胸,剪取右肺上叶相同部位,用滤纸吸去水分和血迹称湿重,置电热恒温烤箱,烘烤 48h至干重恒定称重,计算肺湿/干重比值(W/D)。(3)血浆及肺组织 SOD、MDA:处死大鼠,取动脉血、离心,取上清血浆 -70℃冻存备测;剪取适量肺组织称重、匀浆、低温离心,取上清匀浆液冻存备测。按 SOD、MDA试剂盒说明书,检测血浆、肺匀浆 SOD、MDA。

结 果

1.2h及 6h动脉血氧分压(PaO2)、肺湿干 /重比值(W/D)变化:(1)动脉血氧分压(PaO2):与空白对照组比,2h及 6h,模型组 PaO2明显降低(P＜0.001)。与模型组比,2h及 6h,七叶各剂量组 PaO2明显升高(P＜0.05和 P＜0.001);6h时甲强龙组PaO2明显升高(P＜0.05)。与甲强龙组比,2h时,七叶中、低剂量组 PaO2明显升高(P＜0.01);6h时,七叶各剂量组 PaO2明显升高(P＜0.01和 P＜0.001)。与七叶高剂量组比,2h时,七叶中剂量组 PaO2明显升高(P＜0.05)。(2)肺湿 /干重比(W/D):与空白对照组比,2h及 6h,模型组 W/D明显升高 (P＜0.01)。与模型组比,2h及 6h,七叶各剂量组及甲强龙组 W/D明显降低(P＜0.05和 P＜0.01)。与甲强龙组比,七叶各剂量组 W/D无明显变化(P均 ＞0.05)。七叶各剂量组间 W/D无明显变化(P均 ＞0.05)(表1)。

2.2h及 6h血浆和肺组织 SOD变化:与空白对照组比,2h及 6h,模型组血浆及肺组织 SOD明显降低(P＜0.05或 P＜0.001)。与模型组比,2h时,七叶高、中剂量组血浆 SOD明显升高(P＜0.05和 P＜0.01);6h时,七叶各剂量组及甲强龙组血浆 SOD明显升高(P＜0.05和 P＜0.01);2h时,七叶高剂量组肺匀浆 SOD明显升高(P＜0.05)。与甲强龙组比,2h时,七叶中剂量组血浆 SOD明显升高(P＜0.05);6h时,七叶高、中剂量组血浆 SOD明显升高(P＜0.05)。与七叶中剂量组比,2h时,低剂量组血浆SOD明显降低(P＜0.05)(表2)。

表1 2h、6h时各组 PaO2、W/D变化比较(±+s)

表1 2h、6h时各组 PaO2、W/D变化比较(±+s)

与空白对照组比较,aP＜0.01,aa P＜0.001;与模型组比较,b P＜0.05,bbP＜0.01,bbb P＜0.001;与甲强龙组比较,c P＜0.01,cc P＜0.001;与七叶高剂量组比较,d P＜0.05

组别PaO2(kPa)W/D 2h 6h 2h 6h空白对照组 14.98±1.23 14.74±1.01 4.98±0.10 4.81±0.19模型组 8.42±0.32aa 8.56±0.51aa 5.91±0.15a 5.99±0.10a七叶高剂量组 9.87±0.54b 11.92±0.44bbbc 5.00±0.11b 4.77±0.16b七叶中剂量组 11.63±0.47bbbcd 12.50±0.31bbbcc 5.03±0.14b 4.64±0.20bb七叶低剂量组 11.09±0.22bbbc 12.02±0.51bbbc 5.13±0.27b 4.89±0.12b甲强龙组 9.10±1.07 9.98±0.20b 5.02±0.13b 4.84±0.13b

表2 2h、6h时各组血浆和肺匀浆 SOD变化比较[(U◦mg)/Pro,±+s]

表2 2h、6h时各组血浆和肺匀浆 SOD变化比较[(U◦mg)/Pro,±+s]

与空白对照组比较,a P＜0.05,aaP＜0.001;与模型组比较,b P＜0.05,bbP＜0.01;与甲强龙组比较,c P＜0.05;与七叶中剂量组比较,d P＜0.05

组别 血浆SOD肺匀浆 SOD 2h 6h 2h 6h空白对照组 124.36±4.26 125.21±5.01 132.53±12.11 133.42±13.01模型组 90.01±5.98aa 89.99±6.62aa 98.41±17.92a 100.56±8.69a七叶高剂量组 105.74±6.25b 112.01±7.44bbc 122.79±13.12b 116.57±16.04七叶中剂量组 111.71±7.02bbc 113.12±10.01bbc 114.93±14.48 114.04±14.97七叶低剂量组 99.01±3.75d 106.42±9.64b 108.54±12.11 112.53±15.42甲强龙组 100.56±7.84 110.23±8.43b 107.89±14.52 115.22±18.55

3.2h及 6h血浆和肺组织 MDA变化:与空白对照组比,2h及 6h,模型组血浆及肺组织 MDA明显升高(P＜0.01或 P＜0.001)。与模型组比,2h及 6h,七叶高剂量组血浆 MDA明显降低(P＜0.05);2h时,甲强龙组血浆 MDA明显降低(P＜0.05);2h及6h,七叶各剂量组及甲强龙组肺组织 MDA明显降低(P＜0.05或 P＜0.01)。与甲强龙组比,七叶各剂量组 MDA无明显变化(P＞0.05);七叶各剂量组间MDA无明显变化(P＞0.05)(表3)。

表3 2h、6h时各组血浆和肺匀浆 MDA变化比较[(μmol◦g)/Pro,±+s]

表3 2h、6h时各组血浆和肺匀浆 MDA变化比较[(μmol◦g)/Pro,±+s]

与空白对照组比较,aP＜0.01,aa P＜0.001;与模型组比较,b P＜0.05,bbP＜0.01

组别 血浆MDA肺匀浆 MDA 2h 6h 2h 6h空白对照组 3.56±0.33 3.69±0.42 3.78±0.43 3.84±0.39模型组 5.81±0.67a 5.96±0.91a 6.17±0.65aa 6.39±0.61aa七叶高剂量组 4.43±0.71b 4.50±0.54b 4.73±0.48bb 4.52±0.42bb七叶中剂量组 4.82±0.97 4.87±1.15 4.57±1.56b 4.51±1.20b七叶低剂量组 5.11±0.83 4.89±0.67 4.82±1.23b 4.56±0.85b甲强龙组 4.40±0.72b 4.82±0.74 4.93±0.81b 4.59±0.73b

4.18h时 PaO2、W/D、血浆及肺匀浆 SOD、MDA变化:(1)18h时 PaO2、W/D变化:与空白对照组比,18h,模型组 PaO2明显降低,W/D明显升高(P＜0.05和 P＜0.01);与模型组比,七叶中剂量组和甲强龙组PaO2明显升高,W/D明显降低(P＜0.05);与甲强龙组比,七叶组 PaO2、W/D无明显变化(P＞0.05)(表4)。(2)18h时血浆及肺匀浆 SOD、MDA变化:与空白对照组比,18h,模型组血浆及肺匀浆 SOD明显降低,MDA明显升高(P＜0.05和 P＜0.01);与模型组比,七叶中剂量组和甲强龙组 SOD明显升高,W/D明显降低(P＜0.05);与甲强龙组比,七叶皂苷钠组SOD、MDA无明显变化(P＞0.05)(表5)。

表4 18h时 PaO2、W/D变化结果比较(±+s)

表4 18h时 PaO2、W/D变化结果比较(±+s)

与空白对照组比较,a P＜0.05,aa P＜0.01;与模型组比较,b P＜0.05

组别 /指标 PaO2(kPa) W/D空白对照组 14.56±0.58 3.78±0.19模型组 10.12±0.42aa 5.07±0.13a七叶中剂量组 13.28±0.71b 4.09±0.08b甲强龙组 13.08±0.66b 4.15±0.11b

表5 18h时血浆及肺匀浆 SOD、MDA变化结果比较(±+s)

表5 18h时血浆及肺匀浆 SOD、MDA变化结果比较(±+s)

与空白对照组比较,aP＜0.05,aa P＜0.01;与模型组比较,bP＜0.05

组别 血浆SOD[(U◦mg)/Pro]肺匀浆SOD[(U◦mg)/Pro]血浆MDA[(μmol◦ g)/Pro]肺匀浆MDA[(μmol◦ g)/Pro]空白对照组 123.72±6.78 134.35±11.21 3.78±0.46 3.69±0.54模型组 95.52±5.46a 104.37±10.34aa 5.53±0.46a 5.99±0.42a七叶中剂量组 116.34±12.13b 115.86±20.23b 4.17±0.67b 4.43±0.68b甲强龙组 118.71±12.02b 118.06±11.45b 4.23±0.49b 4.51±0.45b

讨 论

七叶皂苷为七叶树果实娑罗子的提取物,其能促进机体产生 ACTH和 COR,促进血管壁分泌 PGF2α,而具类糖皮质激素抗炎、抗渗出、消肿胀作用[6];其能稳定血管内皮细胞和清除氧自由基,提高静脉张力,促进淋巴回流,改善微循环等,而用于治疗多种临床疾病[7]。有报道,七叶对于肺性脑病患者的临床症状、血气分析等有较好改善作用[8];亦有研究表明,七叶能有效预防严重急性放射性肺损伤,而无激素类不良反应,且能提高患者生活质量[9]。但七叶对 ALI的作用及机制目前还不清楚,故开展预实验观察其对 ALI模型大鼠的作用及可能途径。本研究旨在前期实验基础上,观察不同剂量七叶对 ALI模型大鼠的干预,通过比较不同剂量的效果及机制,筛选合适剂量进行长期疗效观察,探讨其对 ALI模型的远期疗效,从而为使用七叶治疗 ALI提供剂量、时间参考和实验依据。结果表明:与空白对照组比,2h及 6h,模型组 PaO2明显降低,W/D明显升高。与模型组比,2h及 6h,七叶各剂量组 PaO2明显升高、W/D明显降低;6h时甲强龙组 PaO2明显升高;2h及 6h,甲强龙组 W/D明显降低。结果说明不同剂量七叶对油酸制备 ALI大鼠模型均有改善作用。同时,与甲强龙组比,2h时,七叶中、低剂量组 PaO2明显升高;6h时,七叶各剂量组 PaO2明显升高。2h及 6h,七叶各剂量组 W/D均无明显变化。说明七叶对油酸制备 ALI模型 PaO2的改善作用优于甲强龙。

进一步对七叶各剂量组间比较分析,结果发现,与七叶高剂量组相比较,2h时,七叶中剂量组 PaO2明显升高,其他组及时间点 PaO2无明显变化。2h及6h,七叶各剂量组间 W/D无明显变化。结果提示,本实验剂量范围内,七叶无明显剂量效应关系。因PaO2是临床反映 ALI改善的关键指标,七叶中剂量组 PaO2改善作用更明显,而前期预实验更大剂量使用七叶可使大鼠出现血尿(预实验七叶为 12mg/kg和 6mg/kg,12mg/kg七叶使大鼠尿血,6mg/kg没有出现,考虑七叶毒性不良反应,本实验将 6mg/kg设为高剂量),故在七叶对 ALI干预作用相当时,从用药安全性考虑,使用小剂量较好。同时本实验后期为了更好观察七叶对 ALI治疗的长期效应,因在前期实验中有观察 2mg/kg的干预情况,为了再次重复验证,我们选择中剂量 2mg/kg继续观察。结果为:与空白对照组比,18h,模型组 PaO2明显降低,W/D明显升高;与模型组比,七叶中剂量组和甲强龙组 PaO2明显升高,W/D明显降低;与甲强龙组比,七叶组 PaO2、W/D无明显变化。结果说明,18h时,七叶和甲强龙均对油酸制备ALI大鼠模型PaO2、W/D有调节作用,且两者疗效相当。

在观察不同剂量七叶对油酸制备 ALI模型近期作用及远期疗效的同时,我们对其抗炎、抗渗出机制进行相关探讨。研究认为,肺部炎症细胞聚集并释放炎症介质导致肺毛细血管膜通透性增高是 ALI的病理学标志,其中氧自由基为主要炎症介质是造成肺血管损伤的重要因素[10]。ALI时来自中性粒细胞的相关氧自由基清除剂可减轻损伤[11]。SOD能有效清除代谢产生的超氧阴离子自由基,MDA是自由基使细胞膜多不饱和脂肪酸发生过氧化反应的终产物。SOD和 MDA常作为一对指标共同反映自由基代谢及组织受自由基攻击的严重程度,发病早期患者血SOD下降、MDA升高,认为氧化应激在 ALI发生发展中占重要地位[12,13]。结果为:与空白对照组比,2h及6h,模型组血浆及肺组织 SOD明显降低,MDA明显升高。与模型组比,2h时,七叶高、中剂量组血浆SOD明显升高;6h时,七叶各剂量组及甲强龙组血浆SOD明显升高;2h时,七叶高剂量组肺匀浆 SOD明显升高。2h及 6h,七叶高剂量组血浆 MDA明显降低;2h时,甲强龙组血浆 MDA明显降低;2h及 6h,七叶各剂量组及甲强龙组肺组织 MDA明显降低。提示七叶可能通过影响 ALI大鼠体内氧化应激反应发挥抗炎、抗渗出作用。

综上所述,本研究通过观察不同剂量七叶对油酸制备 ALI模型大鼠的干预,证实七叶对 ALI模型的治疗作用;对七叶不同剂量的结果分析,可知其较小剂量安全有效;对合适剂量七叶进行长期疗效观察,表明其对 ALI模型有远期疗效;最后,从氧化应激角度,对七叶抗炎、抗渗出作用机制进行初步探讨,为临床使用七叶治疗 ALI提供剂量、时间和机制的实验依据。同时,本研究还存在不足:前期预实验 12mg/kg七叶使大鼠尿血即停止实验而未观察其他病理损伤,本实验减小剂量观察七叶疗效时,也未对其可能损伤进行病理安全性观察,提示今后研究应对小剂量七叶的疗效和安全性进行全面考察;临床 ALI的病因和发病机制有多种,其对应的药物作用途径和机制也很复杂,氧化应激反应只是其中的一种,其他可能途径有待在后续研究中补充和完善。

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