以Cathelicidin序列为模板设计合成抗菌肽的抗菌特性研究

陈 曼，胡启飞，陈登榜*，吴民泸，代 娟，赖 翼，段佳慧

(1成都医学院，成都610083;2丽珠集团四川光大制药有限公司)

抗菌肽引起人们的广泛重视与它独特的杀菌机制和不易产生耐药性有关，同时其抗菌谱广、杀菌活力强，被认为是能够替代抗生素的首选药物，具有良好的应用前景［1］。但是直接提取或者人工合成的抗菌肽在杀菌的同时经体外实验证实其产生了一定的副作用，如溶血性、细胞毒性等［2］。研究人员试图通过在天然抗菌肽分子组成及结构的基础上，通过保留和去除一部分氨基酸，重新设计合成一些新的多肽，这些多肽能够继承原肽链的生物学活性，同时副作用降低［3］。2010年1月～2011年5月我们进行本研究，使用的抗菌肽设计模板来自于抗菌肽家族Cathelicidin，是通过序列对比设计合成的多肽链［4］，由18个氨基酸组成，本研究将测定此抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抗菌活性及对人红细胞的溶血性等。

1 材料与方法

1.1 材料 抗菌肽序列为GLLRRLRKKIGEIFKKYG，由成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成，纯度92.14%;金黄色葡萄球菌G+，为本实验室保存;氨苄西林购于成都飞奥生物技术有限公司。

1.2 金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定 采用NCCLS推荐的微量稀释试验。2 mg/ml的抗菌肽溶液用水解酪蛋白(MH)肉汤培养基在96微孔板上倍比稀释，使终浓度在512～1μg/ml间成倍比降低，每孔体积100 μl。分别加入106CFU/ml的金黄色葡萄球菌菌液0.1 ml，37℃孵育24 h，观察结果。以不出现云雾状生长的最小肽浓度为MIC。取未浑浊的孔中液体10 μl接种在MH琼脂平板上，37℃孵育24 h，计算菌落数，以能杀死99.9%的细菌的最小肽浓度为MBC。做2个平行实验。

1.3 溶血性分析［2］枸橼酸钠抗凝全血在1 500 r/min离心10 min后得到人红细胞。用等渗的20 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)清洗3次，悬浮到正常红细胞压积的5%。用相同的缓冲液将抗菌肽稀释成不同浓度，分别取体积960 μl加入40 μl的红细胞悬液，37℃孵育30 min，1 500 r/min离心10 min，在540 nm波长下测定上清液的吸光度。等量的缓冲液和红细胞悬液混合后，超声完全破碎红细胞，离心后的上清液作为对照组。

1.4 对金黄色葡萄球菌活力的动力学检测 金黄色葡萄球菌在20 ml LB液体培养基中过夜培养12 h，加入10 ml新鲜培养基，然后将培养物分成相同体积的3份，分别加入相同体积的5×MIC抗菌肽、5×MIC氨苄西林和生理盐水，37℃振荡培养。每隔1 h取样1 ml，连续取样4 h。样品在3 000 r/min离心5 min，保留沉淀物，加入3 ml的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)，离心，重复清洗1次，恢复到原体积。将细菌悬液系列稀释，在MH琼脂平板上计数，做5个平行实验。

1.5 统计学方法 采用SPSS15.0软件进行统计分析，使用t检验方法，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIC和MBC结果 抗菌肽对金黄色葡萄球菌的MIC为16 μg/ml、MBC为128 μg/ml。

2.2 溶血性 以抗菌肽浓度为横坐标，实验组与对照组在540 nm的吸光度的百分比为纵坐标，比较抗菌肽的溶血性，结果抗菌肽浓度为100 μg/ml时，溶血性低于对照组的10%。

2.3 对游离细菌的杀伤活力 经过抗菌肽作用4 h后，抗菌肽组、氨苄西林组、阴性对照组活菌数分别为(5.63±0.10)、(5.83±0.10)、(9.94±0.10)lg (cfu/ml)，阴性对照组比其他两组活菌数均降低(P均＜0.05)。

3 讨论

抗菌肽是生物防御系统的一个重要组成部分，是在生物体受到损伤或感染病菌的情况下产生的一类非专一性免疫应答物，几乎存在于所有动植物中［5］。通过对已知抗菌肽的研究，认为大多数天然抗菌肽具有两个共同特征，即几乎都是阳离子型，及与水和脂类物质都具有亲和力的两亲性结构［6］。对抗菌肽的杀菌机制的研究还没有定论，但是普遍认为与抗菌肽肽链形成的二级结构及抗菌肽的生物学特性有关［7］。

本研究使用的肽链模板来自于抗菌肽家族Cathelicidin，通过对比多条天然抗菌肽的分子结构而得到，新肽链含有能形成α－螺旋结构的分子组成，继承了原肽链的主要理化性质，是具有疏水性、带有正电荷的两性分子［4］。对它的C末端酰胺化以后显示了较强的抗菌活性。经实验测得抗菌肽对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为16 μg/ml和128 μg/ ml，对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。在金黄色葡萄球菌菌液中分别加入5×MIC浓度的抗菌肽和氨苄西林后，经相同条件作用4 h，抗菌肽组和氨苄西林组的活菌数均较阴性对照组降低。同时发现抗菌肽的溶血性远远小于抗菌活性较强的一些天然抗菌肽［8］。进一步说明对抗菌肽分子结构改变和修饰可以保留其抗菌活性并减少副作用。此外，抗菌肽还具有广谱抗菌、不易产生耐药性等特点［9］。

但是抗菌肽的副作用还需要进一步研究，如其是否具有细胞毒性、作用环境对抗菌活性的影响等。研究抗菌肽分子组成与生物学活性的关系不失为好的方法，通过研究氨基酸组成、结构和生物学功能的对应关系，期望研制出有高抑菌活性和较少毒性的抗菌肽，以更好的应用于临床。

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