6种固定液短时间固定对冰冻切片制片效果影响

徐云生 倪开志

冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。由于其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。但在冰冻切片制作过程中，影响制片的质量因素较多，从而影响手术中的快速病理诊断。因此，快速制作一张高质量的冰冻切片对于确保病理诊断极其重要。其中固定是冰冻切片制作中关键步骤之一，对切片的制片质量有着重要的影响。本文通过6种不同固定液短时固定对冰冻切片制片染色的比较，探讨不同固定液对冰冻切片制片效果的影响。

1 资料与方法

1.1 材料 选自楚雄州人民医院病理科手术切除的新鲜组织标本40例，包括有乳腺、甲状腺、胃、子宫、卵巢等组织。

1.2 固定液 6种固定液分别为：10%福尔马林;95%酒精;AF固定液;丙酮∶甲醇∶乙醚酒精(乙醚∶酒精1∶1)。

1.3 方法

1.3.1 取材及切片 取材大小为1.5 cm×1.5 cm，厚2～3 mm的新鲜组织，用OCT包埋剂包埋后，放进徕卡恒温冷冻切片机(温度-18℃ ～20℃)，1～2 min后，每例标本连续切片各6张，厚度4～5 μm。

1.3.2 固定及染色 切片后立即放进上述6种不同的固定液(室温20～25℃)固定6 s。将固定过的切片用蒸馏水洗30 s，放进改良的GILL苏木素液(预先放在65°恒温水域箱加热)2 min，自来水洗，1%盐酸酒精分化液分化10 s，温水(50℃)蓝化30 s，伊红染色30 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2 结果

切片制作好后，通过对6种不同固定液的对比，在显微镜下观察切片的组织清晰度、细胞收缩度、细胞核染色、细胞浆染色、核浆对比情况。结果见表1。

表1 6种不同固定液的对比

从观察结果显示，在6中固定液固定的冰冻切片中，经乙醚酒精固定后的冰冻切片，镜下组织细胞形态清晰，细胞无收缩，细胞核、细胞浆染色鲜艳，核浆对比良好。甲醇固定的冰冻切片质量次之。95%酒精固定的切片，除细胞明显收缩外，组织结构较清晰，细胞染色尚可。丙酮和AF液固定的冰冻切片，组织结构较清晰度稍差，细胞浆染色及核浆对比均差，而且丙酮固定的细胞收缩较为严重。10%福尔马林固定的冰冻切片组织清晰度、细胞核染色、细胞浆染色及核浆比均差，同时细胞肿胀，尤其是细胞核明显肿胀、模糊。

3 讨论

冰冻切片的目的是在短时间内作出准确的病理诊断，协助临床医生确定病变的范围，决定手术的范围，因此，必须尽一切可能争取时间，争取尽快早出切片，并保证质量，所以快速制作一张高质量的冰冻切片非常重要。中华医学会规定完成冰冻HE染色切片制备时间通常为20～25 min［1］，在冰冻切片制片中，固定液的选择及固定的时间长短是冰冻切片HE染色的一个关键步骤。用于冰冻组织的固定液种类较多，大多数固定液需要固定几分钟至十几分钟时间，如果只固定数秒钟，则大多数切片固达不到诊断的要求。由于冰冻切片是由快速切片，快速固定，快速染色这三个方面相互影响所造成的，其中由于组织固定液因素影响组织细胞形态的改变，对病理医生的诊断影响最大，远比其他技术员操作因素引起的组织细胞形态改变更难把握。研究表明10%福尔马林虽然对组织的穿透力强，固定效果好，但需要固定的时间长，而且它不能抵消因冷冻所引起的细胞内液体的肿胀，所以甲醛固定的组织，核发生肿胀、模糊［2］。从上述6种固定液的比较来看，如果只进行数秒钟的短时固定，10%的福尔马林和AF液固定的组织，组织清晰度差，细胞核和细胞浆着色较淡，核浆对比差。95%酒精固定效果尚可，但细胞收缩明显，核浆着色稍差。丙酮固定剂，对组织穿透性强，但细胞严重收缩，核浆对比差。甲醇固定的组织，细胞轻度收缩性，组织结构清晰，核着色好。但是乙醚酒精固定液的冰冻切片能较好的保存细胞的正常结构，组织清晰，背景干净，细胞无收缩，核浆染色鲜艳，核浆对比良好，是6种固定液中最好的。因此，乙醚酒精可以短时间内固定细胞，缩短制片时间，是一种较为理想的冰冻切片快速固定液。

［1］中华医学会.临床技术操作规范，病理学分册．北京：人民军医出版社，2004：10-11．

［2］孙和国，何毅敏．三种固定液对冰冻组织切片固定效果的比较．诊断病理学杂志，2001，8(2)：114．