乙醚提取与固相萃取两种方法对比测定酱油中的苯甲酸

魏然 孙艳波

【摘 要】在测定酱油中苯甲酸过程中，目标峰附近会出现杂质峰，干扰积分进而影响定量。本文采用超高液相色谱法，对用乙醚提取酱油中苯甲酸和用固相萃取法过滤杂质两种提取方式进行对比。在0.01～1.0μg范围内，苯甲酸呈良好的线性关系，相关系数（r）为1;乙醚提取法苯甲酸的回收率为91.34～99.67%，该方法涉及试剂少、处理简单、检测快速准确、易用于实际样品的测定，同时加标回收率更高;固相萃取法苯甲酸的回收率为85.64～93.40%，该方法不需使用毒性大的试剂，分离效果好，基质干扰少，基线平稳更有利于积分。同时，采用超高液相法，苯甲酸出峰在2.3min左右，相较于高效液相色谱法提速近3倍。在实际应用上适合大批量检验任务。

【关键词】超高液相色谱法;酱油;乙醚;固相萃取

中图分类号： O657.72;TQ460.72 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）12-0011-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.12.005

【Abstract】During the determination of benzoic acid in soy sauce，impurity peaks appear near the target peak，which interfere with the integral and then affect the quantification.Ultra-high performance liquid chromatography（Ultra-high performance liquid chromatography） was used to compare the extraction methods of benzoic acid from soy sauce with ether and solid phase extraction（SPE）to filter impurities.In the range of 0.01-1.0 ug，the correlation coefficient（r） is 1.The recovery of benzoic acid by ether extraction method is 91.34-99.67%.This method involves less reagents， simple treatment，rapid and accurate detection，and is easy to be used for the determination of actual samples.The recovery rate of benzoic acid by solid phase extraction is 85.64-93.40%.This method does not need to be used with high toxicity.The reagent has good separation effect，less matrix interference，and stable baseline is more conducive to integration.At the same time，the peak of benzoic acid was about 2.3 minutes by ultra-high performance liquid chromatography，which was nearly three times faster than that by high performance liquid chromatography.In practical application，it is suitable for mass inspection task.

【Key words】Ultra Performance Liquid Chromatography;Soy sauce;Ether;Solid phase

醬油是我国传统调味品，主要以大豆、小麦、食盐等作为原料，经过预处理、发酵、制油等工序酿制而成。由于其中含有丰富的氨基酸、核苷酸、可溶性蛋白质、糖类等营养物质，细菌等微生物的侵袭会使酱油腐败变质。为了防止酱油中微生物的繁殖，大多使用食品防腐剂苯甲酸及其盐类。苯甲酸及其钠盐进入机体后，在肝脏内与甘氨酸结合形成马尿酸， 或与葡萄糖醛酸结合形成葡萄糖苷酸，经尿排出体外。随着现代食品工业的发展，食品添加剂的超量和超范围使用现象十分严重，对食品添加剂的检测也越来越受到人们的重视。

苯甲酸的检测方法主要有紫外分光光度法、气相色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法，其中高效液相色谱法是检测苯甲酸最常用的方法。由于酱油的发酵工艺产生多种有机物，采用GB5009.28-2016第一法高效液相法，按一般性试样处理测定酱油中苯甲酸时会在目标峰前产生杂质峰，尤其是批次量大时，杂质峰会随着样品进针次数的增加，不断增高，不仅影响积分定量，也会极大地降低柱效，因此，在测定前对酱油样品进行纯化处理是十分必要的。

本文采用乙醚提取苯甲酸和固相萃取过滤杂质两种方法对酱油中苯甲酸进行提取，从精密度、稳定性、重复性、加标回收等几个方面展开分析并讨论，以期对日常检测起到借鉴作用。同时引入超高液相色谱法（UPLC），利用其前处理简单、仪器精度高，分析时间更短等优势，增强实验的应用性。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters超高效液相色谱仪，2695紫外检测器，Waters empower工作站（美国Waters公司），C18柱（4.6mm×250mm，10μL），Sartorius CPA225D电子分析天平（德国赛多利斯公司），OASIS？誖HLB固相萃取小柱（3cc，60mg），Agela固相萃取装置。

1.2 对照物质

苯甲酸标准储备液（国家标准物质，GBW（E）100006），由中国计量科学研究院提供。

1.3 超高效液相色谱条件

色谱柱：C18 250mm×4.6mm，5～10μm;流动相：甲醇∶0.02mol/L乙酸铵溶液（5∶95）;流速：1.0mL/min;进样量：5μL;检测器：紫外检测器，波长：230nm。

1.4 标准曲线的制备

使用液的制备（100mg/L）：准确移取1000mg/L储备液1ml，至10ml容量瓶。用水定容。

标曲的配制：分别移取0mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL、10mL使用液，用水定容至10mL，配制成质量浓度分别为0mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L的标准系列工作溶液。取适量标液过0.22μm滤膜，待液相色谱测定。

按1.3中的色谱条件进样分析，以标准浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

1.5 样品的预处理

1.5.1 乙醚法提取样品中苯甲酸

准确称取酱油样品2g于小烧杯中，滴加乙酸数滴调节pH至4～5，转移至20ml容量瓶中，用乙醚润洗小烧杯数次，润洗液合并至容量瓶，用乙醚定容，振摇2min混匀。吸取1ml于试管中，水浴40℃蒸干，加2.0ml流动相溶解。取适量样液过0.22μm滤膜，待液相色谱测定。

1.5.2 固相萃取法提取样品中苯甲酸

准确称取1g样品，加水40ml，用20%磷酸调节pH至1～2，用水定容至50.0ml。取固相萃取柱加5ml甲醇活化，再加5ml水平衡小柱，然后取5.0ml样品清液，以1.0ml/min流速通过萃取住，用5ml5%甲醇-0.1%磷酸溶液清洗萃取柱，弃去清洗液。最后用3ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，用水定容至10ml。取适量样液过0.22μm滤膜，待液相色谱测定。

2 方法与结果

2.1 线性范围的考察

精密吸取苯甲酸溶液（100mg/L）0.1μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、5μL、7μL、10μL。按上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，以进样量（X）为横坐标，以峰面積积分值（Y）为纵坐标进行回归，回归方程为Y=1E+06X+15233。结果显示，进样量在0.01～1.0μg范围内，回归方程相关系数R=1，与峰面积呈良好的线性关系，见图1。

2.2 精密度考察

精密吸取苯甲酸溶液10μL，注入超高效液相色谱仪，重复测定7次，结果RSD%为0.028%，表明精密度良好。

2.3 稳定性试验

取同一份样品，分别在0、1、2、4、8、12h测定，计算苯甲酸含量的RSD%为0.016%，稳定性良好。

2.4 空白试验

取不含苯甲酸的样品分别按照1.5.1，1.5.2项下方法制备试样，测定。空白试样中未出现与苯甲酸标准品保留时间相同的色谱峰，见图。

2.5 重复性试验

精密称取同一样品共6份，分别按照1.5.1，1.5.2项下方法制备试样，测定并计算RSD%。结果乙醚提取苯甲酸平均含量0.219mg/kg，RSD%=1.77%;固相萃取提取苯甲酸平均含量0.202mg/kg，RSD%=2.75%。

2.6 加样回收率试验

按照1.5.1，1.5.2项下方法分别制备试样2组，各三份，同时在称取样品后即在试样中加入苯甲酸标准品，乙醚提取法加入100mg/L苯甲酸3.5ml，固相萃取法加入100mg/L苯甲酸2.5ml。测定结果，乙醚提取法苯甲酸的回收率为91.34～99.67%;固相萃取法苯甲酸的回收率为85.64～93.40%。

3 讨论

参考图5、图6可知，乙醚提取与固相萃取两种方法都可有效地提取目标物，适用于在测定峰附近有杂质峰样品的测定。乙醚提取法将样品经酸化后，用乙醚定量提取，然后取—部分提取液蒸发乙醚后定量溶解，再进行液相色谱测定。该方法涉及试剂少、处理简单、检测快速准确、易用于实际样品的测定，同时加标回收率更高。采用固相萃取法测定实际样品，不需使用毒性大的试剂，分离效果好，基质干扰少，基线平稳更有利于积分，回收率在85.64～93.40%，也完全能满足分析要求。

另外，本文采用了超高液相色谱法，与高效液相色谱法相比，目标峰出峰更快，参考GB 5009.28-2016附录A中给出的色谱图，苯甲酸出峰时间在8min左右，而采用超高液相法，苯甲酸出峰在2.3min左右，提速近3倍，大大缩短了实验周期，节约了流动相的同时，提高了实验的稳定性，在实际应用上适合大批量检验任务。

【参考文献】

[1]刘莉，孙勇，王文平.我国酱油酿造工艺中的现代化技术研究进展[J].中国调味品，2017，（8）：172-180.

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